miR-142-3p通过调控ELAVL1表达影响过氧化氢诱导的心肌细胞损伤的分子机制

doi:10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2019.03.002

目的

探讨微小RNA-142-3p（miR-142-3p）对过氧化氢诱导的心肌细胞损伤的影响及其作用机制。

方法

构建氧化应激损伤模型，以H9C2心肌细胞为研究对象，实验将心肌细胞转染后分为正常对照组、H₂O₂组、H₂O₂+miR-142-3p组、H₂O₂+miR阴性对照组、H₂O₂+?si-?ELAVL1组、H₂O₂+siRNA对照组、H₂O₂+miR-142-3p+pcDNA-ELAVL1组、H₂O₂+miR-?142-3p+pcDNA组。分别采用qRT-PCR与Western Blot检测细胞中miR-142-3p与ELAVL1表达；检测各组活性氧（ROS）生成水平；MTT检测细胞存活率，流式细胞术检测细胞凋亡。双荧光素酶报告实验验证miR-142-3p与ELAVL1的靶向作用。Western Blot检测细胞中Cleaved Caspase-3、STAT3、Caspase-3、p-STAT3蛋白表达。两组间比较采用两样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。

结果

H₂O₂组心肌细胞中miR-142-?3p（0.26±0.06）、p-STAT3表达水平（0.36±0.04）、细胞存活率（61.73±6.48）﹪与正常对照组相比下降（P均< 0.01），而ROS水平（1?566.38±121.57）、细胞凋亡率（27.46±1.73）﹪、Cleaved Caspase-3（0.68±0.08）及ELAVL1表达水平（4.23±0.31）均升高（P均< 0.01）；双荧光素酶报告实验证实ELAVL1是miR-142-3p的靶基因；miR-142-3p过表达或沉默ELAVL1表达可明显促进心肌细胞存活、上调p-STAT3表达，而抑制细胞凋亡及Cleaved Caspase-3表达；ELAVL1过表达可逆转miR-142-3p对过氧化氢处理H9C2细胞的保护作用。

结论

miR-142-?3p可通过抑制ELAVL1表达进而减轻过氧化氢诱导的心肌细胞损伤，其可能通过影响STAT3信号通路而保护心肌细胞。

关键词: miR-142-3p, ELAVL1, 过氧化氢, 心肌细胞

Objective

To investigate the effect of microRNA-142-3p (miR-142-3p) on hydrogen peroxide-induced cardiomyocyte injury and its mechanism.

Methods

The oxidative stress injury model of H9C2 cardiomyocytes was established. H9C2 cardiomyocytes were randomly divided into normal control group, H₂O₂ group, H₂O₂+miR-142-3p group, H₂O₂+miR negative control group, H₂O₂+ si-ELAVL1 group, H₂O₂+ group. siRNA control group, H₂O₂+miR-142-3p+pcDNA-ELAVL1 group, H₂O₂+miR-142-3p+pcDNA group. qRT-PCR and Western Blot were used to detect the expression of miR-142-3p and ELAVL1 in H9C2 cardiomyocytes, respectively. Fluorescence probe method was used to detect the level of reactive oxygen species (ROS) production in H9C2 cardiomyocytes of each group. MTT assay and flow cytometry were used to detect H9C2 cardiomyocyte survival rate and apoptosis rate, respectively. The dual luciferase reporter assay validated the targeting of miR-142-3p and ELAVL1. Western Blot was used to detect the expression of Cleaved Caspase-3, STAT3, Caspase-3 and p-STAT3.

Results

The expression of miR-142-?3p (0.26±0.06) , p-STAT3 expression (0.36±0.04) and cell viability (61.73±6.48) in the H₂O₂ group were significantly lower than those in the normal control group (P?< 0.01) . The ROS level (1566.38±121.57) , apoptosis rate (27.46±1.73) , Cleaved Caspase-3 (0.68±0.08) and ELAVL1 expression level (4.23±0.31) were significantly increased (P?< 0.01) . Dual luciferase reporter assay confirmed that ELAVL1 was a target gene of miR-142-3p. The miR-142-3p overexpression or silencing ELAVL1 could significantly promote the myocardial cell survival, up-regulate the p-STAT3 expression, while inhibit the cardiomyocyte apoptosis and expression of Cleaved Caspase-3.Overexpression of ELAVL1 reversed the protective effect of miR-142-3p on H9C2 cells treated with hydrogen peroxide.

Conclusion

miR-142-3p may attenuate the hydrogen peroxide-induced cardiomyocyte injury by inhibiting the ELAVL1 expression, which may protect cardiomyocytes by affecting the STAT3 signaling pathway.

Key words: MiR-142-3p, ELAVL1, Hydrogen peroxide, Cardiomyocytes

表1 过氧化氢处理心肌细胞影响miR-142-3p和ELAVL1表达（n = 6，±s）

分组	miR-142-3p	ELAVL1 mRNA	ELAVL1蛋白
正常对照组	1.00±0.12	1.01±0.08	0.39±0.04
H₂O₂组	0.26±0.06^a	4.23±0.31^a	0.59±0.06^a
t值	13.511	24.636	6.794
P值	< 0.01	< 0.01	< 0.01

表1 过氧化氢处理心肌细胞影响miR-142-3p和ELAVL1表达（n = 6，±s）

分组	miR-142-3p	ELAVL1 mRNA	ELAVL1蛋白
正常对照组	1.00±0.12	1.01±0.08	0.39±0.04
H₂O₂组	0.26±0.06^a	4.23±0.31^a	0.59±0.06^a
t值	13.511	24.636	6.794
P值	< 0.01	< 0.01	< 0.01

图1 检测心肌细胞中ELAVL1蛋白表达

表2 转染miR-142-3p促进过氧化氢处理心肌细胞增殖并抑制细胞凋亡（n = 6，±s）

分组	miR-142-3p	细胞存活率（﹪）	细胞凋亡率（﹪）	ROS（MFI）
正常对照组	1.00±0.09	100.00±4.89	6.83±0.66	468.43± 68.56
H₂O₂组	0.32±0.04^a	61.73±6.48^a	27.46±1.73^a	1367.17±103.25^a
H₂O₂+ miR阴性对照组	1.27±0.15	56.92±5.79	29.46±1.87	1456.76±121.49
H₂O₂+miR-142-3p组	3.86±0.42^b	79.54±6.28^b	16.43±0.96^b	796.28± 94.45
F值	276.674	66.123	337.789	136.377
P值	< 0.01	< 0.01	< 0.01	< 0.01

表2 转染miR-142-3p促进过氧化氢处理心肌细胞增殖并抑制细胞凋亡（n = 6，±s）

分组	miR-142-3p	细胞存活率（﹪）	细胞凋亡率（﹪）	ROS（MFI）
正常对照组	1.00±0.09	100.00±4.89	6.83±0.66	468.43± 68.56
H₂O₂组	0.32±0.04^a	61.73±6.48^a	27.46±1.73^a	1367.17±103.25^a
H₂O₂+ miR阴性对照组	1.27±0.15	56.92±5.79	29.46±1.87	1456.76±121.49
H₂O₂+miR-142-3p组	3.86±0.42^b	79.54±6.28^b	16.43±0.96^b	796.28± 94.45
F值	276.674	66.123	337.789	136.377
P值	< 0.01	< 0.01	< 0.01	< 0.01

图2 荧光显微镜下观察转染miR-142-3p对过氧化氢诱导的心肌细胞ROS水平（DCF染色，×200）

图3 流式细胞仪检测转染miR-142-3p和过氧化氢处理心肌细胞凋亡

表3 双荧光素酶报告实验（n = 6，±s）

分组	WT- ELAVL1	MUT- ELAVL1
miR阴性对照组	1.03±0.09	1.08±0.09
miR-142-3p组	0.58±0.07^a	0.99±0.08
t值	9.668	1.831
P值	0.000	0.097

表3 双荧光素酶报告实验（n = 6，±s）

分组	WT- ELAVL1	MUT- ELAVL1
miR阴性对照组	1.03±0.09	1.08±0.09
miR-142-3p组	0.58±0.07^a	0.99±0.08
t值	9.668	1.831
P值	0.000	0.097

表4 miR-142-3p靶向ELAVL1调控其表达（n = 6，±s）

分组	ELAVL1
miR阴性对照组	0.34±0.04
miR-142-3p组	0.19±0.03^a
anti-miR阴性对照组	0.41±0.05
anti-miR-142-3p组	0.59±0.09^b
F值	50.489
P值	0.000

表4 miR-142-3p靶向ELAVL1调控其表达（n = 6，±s）

分组	ELAVL1
miR阴性对照组	0.34±0.04
miR-142-3p组	0.19±0.03^a
anti-miR阴性对照组	0.41±0.05
anti-miR-142-3p组	0.59±0.09^b
F值	50.489
P值	0.000

图4 ELAVL1的3'UTR中含有与miR-142-3p互补的核苷酸序列

图5 检测心肌细胞中ELAVL1蛋白表达

表5 沉默ELAVL1促进过氧化氢处理心肌细胞增殖和抑制细胞凋亡（n = 6，±s）

分组	ELAVL1	细胞存活率（﹪）	细胞凋亡率（﹪）	ROS（MFI）
正常对照组	0.36±0.05	100.00±4.73	7.13±0.82	475.82±64.38
H₂O₂组	0.49±0.06^a	62.46±5.87^a	26.49±1.74^a	1566.38±121.57^a
H₂O₂+siRNA对照组组	0.57±0.08	58.92±5.43	29.72±1.88	1387.26±109.83
H₂O₂+ si-ELAVL1组	0.39±0.04^b	82.46±6.38^b	15.39±1.03^b	835.49±89.56^b
F值	15.702	68.826	311.583	154.849
P值	< 0.01	< 0.01	< 0.01	< 0.01

表5 沉默ELAVL1促进过氧化氢处理心肌细胞增殖和抑制细胞凋亡（n = 6，±s）

分组	ELAVL1	细胞存活率（﹪）	细胞凋亡率（﹪）	ROS（MFI）
正常对照组	0.36±0.05	100.00±4.73	7.13±0.82	475.82±64.38
H₂O₂组	0.49±0.06^a	62.46±5.87^a	26.49±1.74^a	1566.38±121.57^a
H₂O₂+siRNA对照组组	0.57±0.08	58.92±5.43	29.72±1.88	1387.26±109.83
H₂O₂+ si-ELAVL1组	0.39±0.04^b	82.46±6.38^b	15.39±1.03^b	835.49±89.56^b
F值	15.702	68.826	311.583	154.849
P值	< 0.01	< 0.01	< 0.01	< 0.01

图6 检测心肌细胞中ELAVL1蛋白表达

表6 过表达ELAVL1部分逆转miR-142-3p对过氧化氢处理心肌细胞的保护作用（n = 6，±s）

分组	ELAVL1	细胞存活率（﹪）	细胞凋亡率（﹪）	ROS（MFI）
正常对照组	0.33±0.04	100.00±5.07	9.53±0.68	503.58± 75.83
H₂O₂组	0.53±0.05^a	60.28±4.66^a	29.46±1.94^a	1489.22±118.23^a
H₂O₂+miR阴性对照组	0.59±0.07	59.31±4.98	31.46±2.07	1436.57±148.67
H₂O₂+miR-142-3p组	0.49±0.05^b	81.82±5.92^b	16.48±1.18^b	858.57± 85.27^b
H₂O₂+miR-142-3p+pcDNA对照组	0.43±0.04	79.63±5.17	15.78±0.89	885.38± 89.53
H₂O₂+miR-142-3p+pcDNA-ELAVL1组	0.54±0.06^c	65.24±4.88^c	21.48±1.56^c	1257.38±119.46^c
F值	78.618	56.974	197.375	74.354
P值	< 0.01	< 0.01	< 0.01	< 0.01

表6 过表达ELAVL1部分逆转miR-142-3p对过氧化氢处理心肌细胞的保护作用（n = 6，±s）

分组	ELAVL1	细胞存活率（﹪）	细胞凋亡率（﹪）	ROS（MFI）
正常对照组	0.33±0.04	100.00±5.07	9.53±0.68	503.58± 75.83
H₂O₂组	0.53±0.05^a	60.28±4.66^a	29.46±1.94^a	1489.22±118.23^a
H₂O₂+miR阴性对照组	0.59±0.07	59.31±4.98	31.46±2.07	1436.57±148.67
H₂O₂+miR-142-3p组	0.49±0.05^b	81.82±5.92^b	16.48±1.18^b	858.57± 85.27^b
H₂O₂+miR-142-3p+pcDNA对照组	0.43±0.04	79.63±5.17	15.78±0.89	885.38± 89.53
H₂O₂+miR-142-3p+pcDNA-ELAVL1组	0.54±0.06^c	65.24±4.88^c	21.48±1.56^c	1257.38±119.46^c
F值	78.618	56.974	197.375	74.354
P值	< 0.01	< 0.01	< 0.01	< 0.01

图7 检测心肌细胞中ELAVL1蛋白表达

表7 miR-142-3p调控ELAVL1对Cleaved Caspase-3、STAT3和p-STAT3的表达（n = 6，±s）

分组	Cleaved Caspase-3	Caspase-3	STAT3	p-STAT3
正常对照组	0.36±0.06	0.68±0.07	0.95±0.07	0.65±0.06
H₂O₂组	0.68±0.08^a	0.65±0.08	0.91±0.06	0.36±0.04^a
H₂O₂+miR-con	0.74±0.06	0.62±0.05	0.96±0.08	0.31±0.05
H₂O₂+miR-142-3p组	0.49±0.05^b	0.65±0.07	0.89±0.09	0.47±0.06^b
H₂O₂+miR-142-3p+pcDNA组	0.52±0.07	0.66±0.08	0.93±0.07	0.48±0.04
H₂O₂+miR-142-3p+pcDNA-ELAVL1组	0.71±0.06^c	0.63±0.07	0.91±0.08	0.31±0.06^c
F值	32.937	0.577	0.745	37.615
P值	0.000	0.717	0.596	0.000

表7 miR-142-3p调控ELAVL1对Cleaved Caspase-3、STAT3和p-STAT3的表达（n = 6，±s）

分组	Cleaved Caspase-3	Caspase-3	STAT3	p-STAT3
正常对照组	0.36±0.06	0.68±0.07	0.95±0.07	0.65±0.06
H₂O₂组	0.68±0.08^a	0.65±0.08	0.91±0.06	0.36±0.04^a
H₂O₂+miR-con	0.74±0.06	0.62±0.05	0.96±0.08	0.31±0.05
H₂O₂+miR-142-3p组	0.49±0.05^b	0.65±0.07	0.89±0.09	0.47±0.06^b
H₂O₂+miR-142-3p+pcDNA组	0.52±0.07	0.66±0.08	0.93±0.07	0.48±0.04
H₂O₂+miR-142-3p+pcDNA-ELAVL1组	0.71±0.06^c	0.63±0.07	0.91±0.08	0.31±0.06^c
F值	32.937	0.577	0.745	37.615
P值	0.000	0.717	0.596	0.000

图8 检测心肌细胞中Cleaved Caspase-3、STAT3和p-STAT3的表达

[1]	Frangogiannis NG. Regulation of the inflammatory response in cardiac repair[J]. Circ Res, 2012, 110(1):159-173.
[2]	Gjesing A,Gislason GH,Køber L, et al. Nationwide trends in development of heart failure and mortality after first-time myocardial infarction 1997-2010: A Danish cohort study[J]. Eur J Intern Med, 2014, 25(8):731-738.
[3]	Carvajal K,Hafidi ME,Baños G. Myocardial damage due to ischemia and reperfusion in hypertriglyceridemic and hypertensive rats[J]. J Hypertens, 1999, 17(11):1607-1616.
[4]	Jin JK,Blackwood EA,Azizi K, et al. ATF6 decreases myocardial ischemia/reperfusion damage and links ER stress and oxidative stress signaling pathways in the heart[J]. Circ Res, 2017, 120(5):862-875.
[5]	Liu XR,Li T,Cao L, et al. Dexmedetomidine attenuates H₂O₂-induced neonatal rat cardiomyocytes apoptosis through mitochondria- and ER-medicated oxidative stress pathways[J]. Mol Med Rep, 2018, 17(5):7258-7264.
[6]	Wang Y,Ouyang M,Wang Q, et al. MicroRNA-142-3p inhibits hypoxia/reoxygenationinduced apoptosis and fibrosis of cardiomyocytes by targeting high mobility group box 1[J]. Int J Mol Med, 2016, 38(5):1377-1386.
[7]	Jeyabal P,Thandavarayan RA,Joladarashi D, et al. MicroRNA-9 inhibits hyperglycemia-induced pyroptosis in human ventricular cardiomyocytes by targeting ELAVL1[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2016, 471(4):423-429.
[8]	曹瑞平,王文连,方婷婷, 等. 激活乙醛脱氢酶2的表达可减轻过氧化氢诱导的心肌细胞损伤[J]. 南方医科大学学报, 2018, 38(8):938-942.
[9]	符丽珍,黄茂芹,劳之勇, 等. miR-221在H₂O₂诱导的大鼠心肌细胞损伤中的作用及机制研究[J]. 中国比较医学杂志, 2017, 27(5):83-88.
[10]	王全伟,凡文博,王智昊, 等. 氧化应激与心血管疾病关系的研究进展[J]. 中国老年学杂志, 2014, 34(1):270-273.
[11]	Coskunpinar E,Cakmak HA,Kalkan AK, et al. Circulating miR- 221- 3p as a novel marker for early prediction of acute myocardial infarction[J]. Gene, 2016, 591(1):90-96.
[12]	Su Q,Li L,Zhao J, et al. MiRNA expression profile of the myocardial tissue of Pigs with coronary microembolization[J]. Cell Physiol Biochem, 2017, 43(3):1012-1024.
[13]	Su Q,Lv X,Ye Z, et al. The mechanism of miR-142-3p in coronary microembolization-induced myocardiac injury via regulating target gene IRAK-1[J]. Cell Death Dis, 2019, 10(2):61.
[14]	Liu BL,Cheng M,Hu S, et al. Overexpression of miR-142-3p improves mitochondrial function in cardiac hypertrophy[J]. Biomedicine c Pharmacotherapy, 2018, 108(1):1347-1356.
[15]	Qin B,Shu Y,Long L, et al. MicroRNA-142-3p induces Atherosclerosis-Associated endothelial cell apoptosis by directly targeting rictor[J]. Cell Physiol Biochem, 2018, 47(4):1589-1603.
[16]	Gu C,Zhang M,Sun W, et al. Upregulation of miR-324-5p inhibits proliferation and invasion of colorectal cancer cells by targeting ELAVL1[J]. Oncol Res, 2019, 27(5):515-524.
[17]	Li X,Zeng L,Cao C, et al. Long noncoding RNA MALAT1 regulates renal tubular epithelial pyroptosis by modulated miR-23c targeting of ELAVL1 in diabetic nephropathy[J]. Exp Cell Res, 2017, 350(2):327-335.
[18]	Nguyen MA,Karunakaran D,Geoffrion M, et al. Extracellular vesicles secreted by atherogenic macrophages transfer MicroRNA to inhibit cell migration[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2018, 38(1):49-63.
[19]	卢叶,陈锐,万静, 等. 微小RNA-30a诱导人心肌细胞凋亡及其机制研究[J]. 临床和实验医学杂志, 2016, 15(22):2180-2185.
[20]	薛玉刚,程锦,曾广伟, 等. miR-214对过氧化氢诱导的心肌细胞凋亡的影响[J]. 临床和实验医学杂志, 2017, 16(17):1692-1695.
[21]	闫世林,罗永百,朱浩锋, 等. CaSR对过氧化氢作用后心肌细胞活性和凋亡影响[J]. 中国循证心血管医学杂志, 2018, 10(4):488-492.

[1]	翁杰, 侯金珍, 汤鲁明, 谢慧, 陈大庆, 孙来芳, 应斌宇, 龚裕强. 脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1在氧化应激介导大鼠肺微血管内皮细胞损伤中的调控作用[J]. 中华危重症医学杂志(电子版), 2016, 09(05): 309-314.
[2]	尹斌, 刘真, 张亚洁, 舒彬, 贾赤宇. miRNA-146a对过氧化氢所致人胃腺癌细胞株AGS氧化应激损伤的影响[J]. 中华损伤与修复杂志(电子版), 2016, 11(06): 416-421.
[3]	施万程, 杨文德, 刘千惠, 黄旭娜, 杨晓锋, 杨尚斌, 方佳峰. 过氧化氢诱导的大鼠盆腔神经节体外损伤模型的构建[J]. 中华普通外科学文献(电子版), 2021, 15(06): 401-405.
[4]	武玉康, 康九红. 多能干细胞在心脏发育和疾病研究中的应用[J]. 中华细胞与干细胞杂志(电子版), 2022, 12(06): 378-382.
[5]	田鹏飞, 王丽娟, 肖圣超. 黄芪总黄酮通过调控miR-190a-5p对缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤的影响[J]. 中华细胞与干细胞杂志(电子版), 2022, 12(06): 346-352.
[6]	姜垠昊, 杨秭莹, 沈晗, 沈振亚. 干细胞心肌分化调控过程中的非编码RNA[J]. 中华细胞与干细胞杂志(电子版), 2022, 12(05): 300-308.
[7]	柯敏霞, 杨黄恬. 心肌微组织的构建及其在心肌损伤修复中的研究进展[J]. 中华细胞与干细胞杂志(电子版), 2022, 12(04): 224-229.
[8]	魏薇, 王文斌, 刘秀梅. circSERPINE2靶向miR-106b-5p对缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤的影响[J]. 中华细胞与干细胞杂志(电子版), 2021, 11(05): 284-291.
[9]	张江河, 李玉红, 李余杰, 张洪壮, 张一鸣. 低浓度过氧化氢对HaCat细胞增殖和大鼠创面愈合的作用与机制研究[J]. 中华细胞与干细胞杂志(电子版), 2021, 11(02): 75-82.
[10]	邴森, 袁博, 王昌育, 万毅. miR-652-3p靶向同源异型核基因1对血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞凋亡的影响[J]. 中华细胞与干细胞杂志(电子版), 2020, 10(01): 7-12.
[11]	董明强, 汪蕊, 王志华, 江炳东. miR-142-3p靶向FSTL1基因对结直肠癌细胞增殖、凋亡以及放疗敏感性的影响[J]. 中华细胞与干细胞杂志(电子版), 2019, 09(04): 216-223.
[12]	王蕊, 郝翠君, 周金才, 张占帅, 曹佳, 袁桂莉, 石金铮. 二氢杨梅素对高糖诱导的H9C2心肌细胞损伤的影响[J]. 中华细胞与干细胞杂志(电子版), 2019, 09(03): 160-165.
[13]	方媛, 郭统帅, 吴岳, 刘洋, 曹瑜梦, 雷新军. 高糖通过诱导自噬障碍促进心肌细胞H9c2凋亡[J]. 中华细胞与干细胞杂志(电子版), 2018, 08(03): 134-139.
[14]	张在其, 幸小亮, 贺凯, 黄雪霜, 杨勇, 张荔铭. 一氧化碳释放分子3对缺氧/复氧心肌细胞内活性氧的影响[J]. 中华卫生应急电子杂志, 2016, 02(01): 33-36.

阅读次数

全文

摘要

选择文件类型/文献管理软件名称

选择包含的内容

Molecular mechanism of miR-142-3p in the injury induced by hydrogen peroxide by regulating ELAVL1

模态框（Modal）标题

选择文件类型/文献管理软件名称

选择包含的内容

Molecular mechanism of miR-142-3p in the injury induced by hydrogen peroxide by regulating ELAVL1