miR-142-3p靶向FSTL1基因对结直肠癌细胞增殖、凋亡以及放疗敏感性的影响

doi:10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2019.04.005

目的

探究miR-142-3p靶向卵泡抑素样蛋白1（FSTL1）对结直肠癌（CRC）细胞增殖、凋亡以及放疗敏感性的影响。

方法

培养正常人结肠细胞FHC与CRC细胞系SW480、DLD-1、HCT116和Caco-2，qRT-PCR检测细胞中miR-142-3P水平，Western Blot检测FSTL1蛋白水平；分别转染miR-142-3p模拟物（miR-142-3p组）、模拟物阴性对照（miR-NC组）、FSTL1的si-RNA9（si-FSTL1组）、si-RNA阴性对照（si-con组）至CRCSW480细胞，MTT检测细胞增殖情况，流式细胞仪检测细胞凋亡水平，Western Blot检测增殖、凋亡相关蛋白水平，克隆形成实验检测放射敏感性；双荧光素酶报告基因、Western Blot验证miR-142-3p与FSTL1关系及在CRC中作用。采用t检验和方差分析进行统计学分析。

结果

CRC细胞SW480、DLD-?1、HCT116、Caco-2中miR-142-3p水平（0.86±0.09、1.09±0.11、0.76±0.08、0.98±0.10）低于正常结肠细胞FHC （2.56±0.26），差异具有统计学意义（t?= 18.536，15.621，19.851，17.016，P均< 0.01），FSTL1 mRNA水平2.26±0.23、1.39±0.14、2.01±0.20、1.98±0.19高于FHC细胞（0.79±0.08），差异具有统计学意义（t?= 18.110，11.163，16.991，17.317，P均?< 0.01），FSTL1蛋白水平（1.16±0.12、1.09±0.11、0.96±0.09、0.95±0.10）高于FHC细胞（0.37±0.04），差异有统计学意义（t?= 18.736，18.454，17.972，16.155，P均?< 0.01）；miR-?142-?3p组CRC细胞SW480凋亡率（30.23±3.10）和Bax水平（1.02±0.11）高于miR-?con?组8.96±0.89，0.45±0.05，t?= 19.785，14.152，P均< 0.01，72?h细胞增殖活力（1.16±0.11）、CyclinD1 （0.35±0.05）、Bcl-2 （0.38±0.04）、8?Gy （7.56±0.75）细胞存活率低于miR-con组（1.60±0.16，1.02±0.12，0.98±0.10，10.35±1.25，t?= 6.798，15.462，16.713，5.742，P均< 0.01）；si-FSTL1组SW480细胞72?h的细胞增殖活力（1.05±0.11）、CyclinD1（0.40±0.05）、Bcl-2（0.42±0.05）低于si-?con组（1.60±0.16，1.05±0.10，1.00±0.12，t?= 8.498，17.441，13.385，P均< 0.01），Bax（1.00±0.11）高于si-con组（0.41±0.04，t?= 15.122，P?< 0.01）；miR-?142-3p负调控FSTL1表达，过表达FSTL1逆转了miR-142-3p过表达SW480细胞增殖、凋亡及放射敏感性的影响。

结论

过表达miR-142-3p可能通过下调FSTL1表达抑制CRC细胞增殖，诱导其凋亡，并增强其放疗敏感性。

关键词: miR-142-3p, 卵泡抑素样蛋白1, 结直肠癌, 增殖, 凋亡, 放疗敏感性

Objective

To investigate the effects of microRNA-142-3p targeting follistatin-?like protein 1 on proliferation, apoptosis and radiosensitivity of colorectal cancer cells.

Methods

The normal human colon cell FHC and CRC cell lines SW480, DLD-1, HCT116 and Caco-2 were cultured, the level of miR-142-3P was detected by qRT-PCR, and the level of FSTL1 protein was detected by Western Blot. MiR-142-3p mimics (miR-142-3p group) , mimics negative control (miR-NC group) , si-RNA of FSTL1 (si-FSTL1 group) , si-RNA negative control (si-?con group) were transfected into CRC SW480 cells, respectively. MTT was used to detect cell proliferation, flow cytometry was used to detect cell apoptosis, Western Blot was used to detect the levels of proliferation and apoptosis-related proteins, and cloning formation assay was used to detect radiosensitivity. Luciferase and Western Blot were used to verify the relationship between microRNA-142-3p and FSTL1 and its role in colorectal cancer. Statistical analysis was performed using t test and analysis of variance.

Results

The levels of miR-142-3p in colorectal cancer cells SW480, DLD-1, HCT116, and Caco-2 (0.86±0.09, 1.09±0.11, 0.76±0.08, 0.98±0.10) were lower than those of normal Colonic cells FHC (2.56±0.26, t?= 18.536, 15.621, 19.851, 17.016, P?< 0.01) , FSTL1 mRNA levels (2.26±0.23, 1.39±0.14 , 2.01±0.20, 1.98±0.19) were higher than FHC cell levels (0.79±0.08, t?= 18.110, 11.163, 16.991, 17.317, P?< 0.01) , and FSTL1 protein levels (1.16±0.12, 1.09±0.11, 0.96±0.09, 0.95±0.10) were higher than FHC cell levels (0.37±0.04, t?= 18.736, 18.454, 17.972, 16.155, P?< 0.01) ; the apoptosis rate of colorectal cancer cell SW480 in miR-142-3p group (30.23±3.10) and Bax level (1.02±0.11) were higher than that in miR-con group (8.96±0.89, t?= 19.785, P?< 0.01; 0.45±0.05, t?= 14.152, P?< 0.01) , and cell proliferation activity for 72?h (1.16±0.11) , the levels of CyclinD1 (0.35±0.05) and Bcl-2 (0.38±0.04) , and the cell survival rate after 8?Gy were lower than that of the miR-con group (1.60±0.16, t?= 6.798, P?< 0.01; 1.02±0.12, t?= 15.462, P?< 0.01; 0.98±0.10, t?= 16.713, P?< 0.01; 10.35±1.25, t?= 5.742, P?< 0.01) ; the cell proliferation activity (1.05±0.11) and the levels of CyclinD1 (0.40±0.05) and Bcl-2 (0.42±0.05) in si-FSTL1 group were lower than si-con group (1.60±0.16, t?= 8.498, P?< 0.01; 1.05±0.10, t?= 17.441, P?< 0.01; 1.00±0.12, t?= 13.385, P?< 0.01) , and Bax (1.00±0.11) was higher than si-con group (0.41±0.04, t?= 15.122, P?< 0.01) ; miR-142-3p negatively regulated the expression of FSTL1, and overexpression of FSTL1 reversed the effect of miR-142-3p overexpressing on the proliferation, apoptosis and radiosensitivity of SW480 cells.

Conclusion

Overexpression of miR-?142-3p may inhibit the proliferation of colorectal cancer cells, induce apoptosis and enhance the sensitivity of radiotherapy by down-regulating FSTL1 expression.

Key words: MicroRNA-142-3p, FSTL1, Colorectal cancer, Proliferation, Apoptosis, Radiotherapy sensitivity

图1 miR-142-3p和FSTL1在结直肠癌细胞系中的表达水平

图2 结直肠癌细胞中FSTL1蛋白表达条带

图3 流式细胞仪检测过表达miR-142-3p后的SW480细胞凋亡情况

图4 MTT法检测过表达miR-142-3p后的SW480细胞OD值

图5 CyclinD1、Bax和Bcl-2蛋白表达条带

表1 过表达miR-142-3p对结直肠癌SW480细胞增殖和凋亡的影响（ ± s）

分组	样本量	miR-142-3p	CyclinD1	Bax	Bcl-2	细胞增殖活力（OD 490?nm ）			凋亡率（﹪）
分组	样本量	miR-142-3p	CyclinD1	Bax	Bcl-2	24?h	48?h	72?h	凋亡率（﹪）
NC组	9	0.85±0.09	1.00±0.11	0.40±0.04	1.00±0.10	0.65±0.07	1.08±0.11	1.68±0.15	9.01±0.91
miR-con组	9	0.88±0.09	1.02±0.12	0.45±0.05	0.98±0.10	0.63±0.07	1.01±0.10	1.60±0.16	8.96±0.89
miR-142-3p组	9	2.99±0.30^a	0.35±0.05^a	1.02±0.11^a	0.38±0.04^a	0.58±0.06	0.82±0.08^a	1.16±0.11^a	30.23±3.10^a
F值	?	382.737	135.279	197.722	155.167	2.619	17.147	35.163	361.718
P值	?	< 0.05	< 0.05	< 0.05	< 0.05	< 0.05	< 0.05	< 0.05	< 0.05

表1 过表达miR-142-3p对结直肠癌SW480细胞增殖和凋亡的影响（ ± s）

分组	样本量	miR-142-3p	CyclinD1	Bax	Bcl-2	细胞增殖活力（OD 490?nm ）			凋亡率（﹪）
分组	样本量	miR-142-3p	CyclinD1	Bax	Bcl-2	24?h	48?h	72?h	凋亡率（﹪）
NC组	9	0.85±0.09	1.00±0.11	0.40±0.04	1.00±0.10	0.65±0.07	1.08±0.11	1.68±0.15	9.01±0.91
miR-con组	9	0.88±0.09	1.02±0.12	0.45±0.05	0.98±0.10	0.63±0.07	1.01±0.10	1.60±0.16	8.96±0.89
miR-142-3p组	9	2.99±0.30^a	0.35±0.05^a	1.02±0.11^a	0.38±0.04^a	0.58±0.06	0.82±0.08^a	1.16±0.11^a	30.23±3.10^a
F值	?	382.737	135.279	197.722	155.167	2.619	17.147	35.163	361.718
P值	?	< 0.05	< 0.05	< 0.05	< 0.05	< 0.05	< 0.05	< 0.05	< 0.05

表2 放射线对过表达miR-142-3p的结直肠癌SW480细胞存活率的影响（ ± s）

分组	样本量	细胞存活率（﹪）
分组	样本量	0?Gy	2?Gy	4?Gy	6?Gy	8?Gy
NC组	9	102.01±10.01	92.56±9.25	55.26±5.53	36.58±3.53	11.05±1.10
miR-con组	9	100.01± 9.86	90.11±9.01	52.86±5.29	33.43±3.32	10.35±0.25
miR-142-3p组	9	103.05±10.30	76.43±7.52^a	31.26±3.13^a	9.05±0.90^a	7.56±0.75^a
F值	?	0.212	9.136	69.007	252.330	50.160
P值	?	0.810	0.001	< 0.05	< 0.05	< 0.05

表2 放射线对过表达miR-142-3p的结直肠癌SW480细胞存活率的影响（ ± s）

分组	样本量	细胞存活率（﹪）
分组	样本量	0?Gy	2?Gy	4?Gy	6?Gy	8?Gy
NC组	9	102.01±10.01	92.56±9.25	55.26±5.53	36.58±3.53	11.05±1.10
miR-con组	9	100.01± 9.86	90.11±9.01	52.86±5.29	33.43±3.32	10.35±0.25
miR-142-3p组	9	103.05±10.30	76.43±7.52^a	31.26±3.13^a	9.05±0.90^a	7.56±0.75^a
F值	?	0.212	9.136	69.007	252.330	50.160
P值	?	0.810	0.001	< 0.05	< 0.05	< 0.05

图6 流式细胞仪检测敲减FSTL1后SW480细胞凋亡情况

图7 MTT检测敲减FSTL1后的SW480细胞OD值

图8 敲减FSTL1后的SW480细胞FSTL1、CyclinD1、Bax和Bcl-2蛋白表达条带

表3 敲减FSTL1对结直肠癌SW480细胞增殖和凋亡的影响（ ± s）

分组	样本量	FSTL1	CyclinD1	Bax	Bcl-2	细胞增殖活力（OD-490nm ）			凋亡率（﹪）
分组	样本量	FSTL1	CyclinD1	Bax	Bcl-2	24 h	48 h	72 h	凋亡率（﹪）
NC组	9	1.18±0.14	1.00±0.10	0.39±0.04	1.01±0.11	0.60±0.07	1.03±0.11	1.65±0.15	9.25±0.93
si-con组	9	1.15±0.12	1.05±0.10	0.41±0.04	1.00±0.12	0.60±0.07	1.00±0.10	1.60±0.16	9.01±0.91
si-FSTL1组	9	0.41±0.05^a	0.40±0.05^a	1.00±0.11^a	0.42±0.05^a	0.55±0.06	0.78±0.08^a	1.05±0.11^a	28.03±2.91^a
F值	?	140.721	157.000	211.941	119.407	1.679	17.653	60.090	316.430
P值	?	< 0.05	< 0.05	< 0.05	< 0.05	0.208	< 0.05	< 0.05	< 0.05

表3 敲减FSTL1对结直肠癌SW480细胞增殖和凋亡的影响（ ± s）

分组	样本量	FSTL1	CyclinD1	Bax	Bcl-2	细胞增殖活力（OD-490nm ）			凋亡率（﹪）
分组	样本量	FSTL1	CyclinD1	Bax	Bcl-2	24 h	48 h	72 h	凋亡率（﹪）
NC组	9	1.18±0.14	1.00±0.10	0.39±0.04	1.01±0.11	0.60±0.07	1.03±0.11	1.65±0.15	9.25±0.93
si-con组	9	1.15±0.12	1.05±0.10	0.41±0.04	1.00±0.12	0.60±0.07	1.00±0.10	1.60±0.16	9.01±0.91
si-FSTL1组	9	0.41±0.05^a	0.40±0.05^a	1.00±0.11^a	0.42±0.05^a	0.55±0.06	0.78±0.08^a	1.05±0.11^a	28.03±2.91^a
F值	?	140.721	157.000	211.941	119.407	1.679	17.653	60.090	316.430
P值	?	< 0.05	< 0.05	< 0.05	< 0.05	0.208	< 0.05	< 0.05	< 0.05

图9 生物信息软件预测miR-142-3p与FSTL1靶向关系

图10 FSTL1蛋白表达条带

表4 双荧光素酶活性检测结果（ ± s）

分组	样本量	荧光素酶活性
分组	样本量	WT	MUT
miR-con组	9	1.00±0.17	1.00±0.15
miR-142-3p组	9	0.37±0.05	0.95±0.09
t值	?	8.709	0.700
P值	?	< 0.05	0.500

表4 双荧光素酶活性检测结果（ ± s）

分组	样本量	荧光素酶活性
分组	样本量	WT	MUT
miR-con组	9	1.00±0.17	1.00±0.15
miR-142-3p组	9	0.37±0.05	0.95±0.09
t值	?	8.709	0.700
P值	?	< 0.05	0.500

表5 miR-142-3p对FSTL1蛋白表达影响（ ± s）

分组	样本量	FSTL1蛋白
miR-con组	9	1.12±0.11
miR-142-3p组	9	0.49±0.05^a
anti-miR-con组	9	1.15±0.11
anti-miR-142-3p组	9	0.78±0.08^b
F值	?	141.390
P值	?	< 0.05

表5 miR-142-3p对FSTL1蛋白表达影响（ ± s）

分组	样本量	FSTL1蛋白
miR-con组	9	1.12±0.11
miR-142-3p组	9	0.49±0.05^a
anti-miR-con组	9	1.15±0.11
anti-miR-142-3p组	9	0.78±0.08^b
F值	?	141.390
P值	?	< 0.05

图11 流式细胞仪检测高表达FSTL1部分恢复miR-142-3p对结直肠癌SW480凋亡的影响

图12 MTT法检测高表达FSTL1部分恢复miR-142-3p对结直肠癌SW480细胞增殖的影响

图13 FSTL1、CyclinD1、Bax和Bcl-2蛋白表达条带

表6 FSTL1高表达部分恢复miR-142-3p对抑制结直肠癌SW480细胞增殖和凋亡的影响（ ± s）

分组	样本量	FSTL1	CyclinD1	Bax	Bcl-2	细胞增殖活力（OD 490 nm ）			凋亡率（﹪）
分组	样本量	FSTL1	CyclinD1	Bax	Bcl-2	24 h	48 h	72 h	凋亡率（﹪）
miR-con组	9	1.10±0.11	1.05±0.12	0.41±0.04	1.02±0.11	0.63±0.07	1.05±0.10	1.65±0.16	8.81±0.87
miR-142-3p组	9	0.45±0.05^a	0.36±0.05^a	1.03±0.11^a	0.40±0.04^a	0.58±0.06	0.77±0.08^a	1.13±0.12^a	29.10±2.94^a
miR-142-3p+pcDNA-con组	9	0.48±0.05	0.35±0.05	1.01±0.11	0.39±0.04	0.59±0.06	0.81±0.09	1.16±0.12	28.21±2.82
miR-142-3p+pcDNA-FSTL1组	9	0.88±0.09^b	0.85±0.09^b	0.75±0.08^b	0.88±0.09^b	0.63±0.06	0.99±0.10^b	1.68±0.17^b	15.11±1.61^b
F值	?	190.651	217.644	125.019	217.350	2.115	25.739	52.110	239.831
P值	?	< 0.05	< 0.05	< 0.05	< 0.05	0.112	< 0.05	< 0.05	< 0.05

表6 FSTL1高表达部分恢复miR-142-3p对抑制结直肠癌SW480细胞增殖和凋亡的影响（ ± s）

分组	样本量	FSTL1	CyclinD1	Bax	Bcl-2	细胞增殖活力（OD 490 nm ）			凋亡率（﹪）
分组	样本量	FSTL1	CyclinD1	Bax	Bcl-2	24 h	48 h	72 h	凋亡率（﹪）
miR-con组	9	1.10±0.11	1.05±0.12	0.41±0.04	1.02±0.11	0.63±0.07	1.05±0.10	1.65±0.16	8.81±0.87
miR-142-3p组	9	0.45±0.05^a	0.36±0.05^a	1.03±0.11^a	0.40±0.04^a	0.58±0.06	0.77±0.08^a	1.13±0.12^a	29.10±2.94^a
miR-142-3p+pcDNA-con组	9	0.48±0.05	0.35±0.05	1.01±0.11	0.39±0.04	0.59±0.06	0.81±0.09	1.16±0.12	28.21±2.82
miR-142-3p+pcDNA-FSTL1组	9	0.88±0.09^b	0.85±0.09^b	0.75±0.08^b	0.88±0.09^b	0.63±0.06	0.99±0.10^b	1.68±0.17^b	15.11±1.61^b
F值	?	190.651	217.644	125.019	217.350	2.115	25.739	52.110	239.831
P值	?	< 0.05	< 0.05	< 0.05	< 0.05	0.112	< 0.05	< 0.05	< 0.05

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