二甲双胍对人脐带间充质干细胞形态、增殖、表面标志及细胞周期的影响

doi:10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2019.04.006

目的

探讨不同浓度二甲双胍（METF）对人脐带间充质干细胞（hUC-MSC）形态、增殖、表面标志及细胞周期的影响。

方法

取健康足月新生儿脐带在体外分离出hUC-MSC进行传代培养，至第3代（流式细胞仪分析）对细胞进行鉴定，取第6代处于对数生长期的hUC-MSC （相对老化），将对照组与不同浓度METF （0.1，1，5，10，20?mmol/L）干预的细胞进行比较，观察不同浓度METF干预对细胞的形态、增殖率（MTT法分别于24、48、72?h检测）、及细胞表面标志和细胞周期的影响，采用One-Way ANOVA，及LSD-t检验进行统计学分析。

结果

（1）METF为0.1?mmol/L、1?mmol/L，细胞形态无显著改变，当药物浓度为5?~?20?mmol/?L时，随着药物浓度增加、培养时间延长，细胞形态改变越显著。（2）METF为0.1?mmol/L（24?h：101.28±0.98，24?h：104.06±1.76，24?h：101.51±0.67）促进hUC-MSC增殖，药物浓度为1?~ 10?mmol/L在培养初期可增加间充质干细胞的增殖率，随着培养时间的延长，细胞的增殖逐渐被抑制。METF为20?mmol/L（24?h：86.64±0.66，48?h：58.38±2.52，72?h：17.75±1.35）抑制细胞增殖，抑制作用随着时间延长而增强（P?< 0.05）。（3）当METF浓度为5，10，20?mmol/L时，随着药物浓度的增加，CD105的表达逐渐减弱（F?= 17.539，P?< 0.05）。METF未对CD44、CD90产生影响。（4）METF为0.1?mmol/L时降低G0/G1期的比例（64.16±1.20，P?< 0.05），促进间充质干细胞的增殖，随着药物浓度的增加，细胞增殖逐渐被抑制。

结论

METF浓度在0.1mmol/?L促进hUC-MSC增殖，而在浓度5 ~ 20?mmol/L时抑制人脐带间充质干细胞的增殖及表面标志CD105的表达，不同浓度的METF均未对CD44、CD90的表达产生影响。

关键词: 脐带间充质干细胞, 二甲双胍, 生物治疗, 细胞增殖

Objective

To study the effects of different concentrations of metformin on morphology, proliferation, surface markers and cell cycle of human umbilical cord mesenchymal stem cells (hUC-MSC) .

Methods

hUC-MSC were isolated from the umbilical cord of full-term newborns in vitro for subculture. The 6th generation of hUC-MSCs in logarithmic growth phase were used in the study. The control group was compared with different concentrations of metformin (0.1, 1, 5, 10, 20 mmol/L) to observe the morphology of cells treated with different concentrations of metformin. The effects of proliferation rate (MTT method) , cell surface markers and cell cycle (flow cytometry analysis) were analyzed by One-Way ANOVA and LSD-t test.

Results

(1) METF was 0.1?mmol/L, 1?mmol/L, and the cell morphology did not change significantly. When the drug concentration was 5?~ 20?mmol/L, the cell morphology changed more obviously with the increase of drug concentration and culture time. (2) When METF was 0.1?mmol/L (highest 104.06±1.76) , it promoted the proliferation of hUC-MSC. The drug concentration of 1?~ 10?mmol/L could increase the proliferation rate of mesenchymal stem cells in the early stage of culture. With the prolongation of culture time, the cells proliferation was gradually suppressed. METF was 20?mmol/L (24?h: 86.64±0.66, 48?h: 58.38±2.52, 72?h: 17.75±1.35) to inhibit cell proliferation, and the inhibition increased with time (P?< 0.05) . When the concentration of metformin was 5, 10, 20?mmol/L, the expression of CD105 gradually decreased with the increase of drug concentration (F?= 17.539, P?< 0.05) . Metformin did not affect CD44 and CD90. When metformin was 0.1?mmol/L, the ratio of G0/?G1 phase was decreased (64.16±1.20, P?< 0.05) , which promoted the proliferation of mesenchymal stem cells. With the increase of drug concentration, cell proliferation was gradually inhibited.

Conclusion

Metformin can promote the proliferation of hUC-MSC at the concentration of 0.1?mmol/L, and inhibit the proliferation of hUC-MSC and the expression of CD105 at the concentration of 5?~ 20?mmol/L. All different concentrations of metformin would influence the expressions of CD44 and CD90.

Key words: Umbilical cord mesenchymal stem cells, Metformin, Biological therapy, Cell proliferation

图1 倒置显微镜下观察各组细胞在不同浓度METF影响下的形态（×100）

图2 MTT比色法检测相对增殖率

表1 不同时间各组培养的hUC-MSC相对增殖率（n = 3，﹪， ± s）

分组	24 h	48 h	72 h
对照组	100	100	100
0.1 mmol/L组	101.28±0.98	104.06±1.76^a	101.51±0.67
1 mmol/L组	116.03±1.82^b	84.20±1.60^b	70.98±2.47^b
5 mmol/L组	115.13±3.06^b	64.64±1.20^b	43.83±2.38^b
10 mmol/L组	108.37±1.26^b	59.69±1.90^b	25.58±0.61^b
20 mmol/L组	86.64±0.66^b	58.38±2.52^b	17.75±1.35^b
F值	140.275	442.340	1668.204
P值	< 0.01	< 0.01	< 0.01

表1 不同时间各组培养的hUC-MSC相对增殖率（n = 3，﹪， ± s）

分组	24 h	48 h	72 h
对照组	100	100	100
0.1 mmol/L组	101.28±0.98	104.06±1.76^a	101.51±0.67
1 mmol/L组	116.03±1.82^b	84.20±1.60^b	70.98±2.47^b
5 mmol/L组	115.13±3.06^b	64.64±1.20^b	43.83±2.38^b
10 mmol/L组	108.37±1.26^b	59.69±1.90^b	25.58±0.61^b
20 mmol/L组	86.64±0.66^b	58.38±2.52^b	17.75±1.35^b
F值	140.275	442.340	1668.204
P值	< 0.01	< 0.01	< 0.01

图3 不同浓度METF对CD105的影响

表2 共培养24 h后不同浓度METF对hUC-MSC表面标记的影响（n = 3， ± s）

分组	CD44	CD90	CD105
对照组	0.75±0.18	96.96±0.44	72.80±2.90
0.1 mmol/L组	0.53±0.25	96.93±0.89	76.75±2.15
1 mmol/L组	0.53±0.08	97.54±0.22	72.88±2.37
5 mmol/L组	0.50±0.24	97.21±0.47	66.52±2.70^a
10 mmol/L组	0.60±0.14	97.47±0.31	66.74±4.33^a
20 mmol/L组	0.62±0.28	97.67±0.22	57.25±6.92^b
F值	0.731	1.232	17.539
P值	> 0.05	> 0.05	< 0.01

表2 共培养24 h后不同浓度METF对hUC-MSC表面标记的影响（n = 3， ± s）

分组	CD44	CD90	CD105
对照组	0.75±0.18	96.96±0.44	72.80±2.90
0.1 mmol/L组	0.53±0.25	96.93±0.89	76.75±2.15
1 mmol/L组	0.53±0.08	97.54±0.22	72.88±2.37
5 mmol/L组	0.50±0.24	97.21±0.47	66.52±2.70^a
10 mmol/L组	0.60±0.14	97.47±0.31	66.74±4.33^a
20 mmol/L组	0.62±0.28	97.67±0.22	57.25±6.92^b
F值	0.731	1.232	17.539
P值	> 0.05	> 0.05	< 0.01

图4 不同浓度METF对hUC-MSC细胞周期的影响

图5 不同浓度METF对hUC-MSC增殖指数的影响

表3 不同浓度METF作用48 h后hUC-MSC细胞周期的影响（n = 3，﹪， ± s）

分组	G0/G1（﹪）	S（﹪）	G2/M（﹪）
对照组	66.40±2.65	29.03±3.19	3.56±2.20
0.1 mmol/L组	64.16±1.20^b	29.47±1.00	6.37±0.40^a
1 mmol/L组	72.89±1.14^b	24.19±2.16^a	2.34±1.02
5 mmol/L组	73.59±1.58^b	20.92±0.77^b	5.48±0.84
10 mmol/L组	77.55±1.25^b	16.32±1.10^b	6.18±1.01^a
20 mmol/L组	83.85±1.68^b	13.68±1.67^b	2.47±0.23
F值	122.456	1.232	17.539
P值	< 0.01	< 0.01	> 0.05

表3 不同浓度METF作用48 h后hUC-MSC细胞周期的影响（n = 3，﹪， ± s）

分组	G0/G1（﹪）	S（﹪）	G2/M（﹪）
对照组	66.40±2.65	29.03±3.19	3.56±2.20
0.1 mmol/L组	64.16±1.20^b	29.47±1.00	6.37±0.40^a
1 mmol/L组	72.89±1.14^b	24.19±2.16^a	2.34±1.02
5 mmol/L组	73.59±1.58^b	20.92±0.77^b	5.48±0.84
10 mmol/L组	77.55±1.25^b	16.32±1.10^b	6.18±1.01^a
20 mmol/L组	83.85±1.68^b	13.68±1.67^b	2.47±0.23
F值	122.456	1.232	17.539
P值	< 0.01	< 0.01	> 0.05

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