普鲁卡因通过上调lncRNA DGCR5抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭

doi:10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2024.03.004

目的

探究普鲁卡因在胃癌细胞迁移、侵袭和增殖中的作用及潜在机制。

方法

胃癌AGS细胞分为普鲁卡因低、中、高剂量组（分别用含3、6、12 mmol/L普鲁卡因的培养基干预AGS细胞24 h）、pcDNA-lncRNA DGCR5组（常规培养基培养转染lncRNA DGCR5过表达载体的AGS细胞24 h）、pcDNA-NC组（常规培养基培养转染空载体的AGS细胞24 h）、高剂量+si-lncRNA DGCR5组（含12 mmol/L普鲁卡因的培养基干预转染lncRNA DGCR5小干扰RNA的AGS细胞24 h）、高剂量+si-NC组（含12 mmol/L普鲁卡因的培养基干预转染乱序无意义阴性序列的AGS细胞24 h）和对照组（AGS细胞常规培养24 h），分别采用MTT、克隆形成、划痕愈合、Transwell和蛋白印迹法检测细胞增殖、迁移和侵袭及细胞中MMP2、MMP9蛋白表达，RT-qPCR法检测lncRNA DGCR5表达。两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析和LSD-t检验。

结果

与对照组比较，普鲁卡因低、中、高剂量组AGS细胞A值、克隆数、划痕愈合率、迁移数和侵袭数及MMP2和MMP9蛋白表达量均降低（P均< 0.05），lncRNA DGCR5表达升高（1.69 ± 0.13、2.18 ± 0.17、2.49 ± 0.15比1.00 ± 0.10，P < 0.05）。与pcDNA-NC组比较，pcDNA-lncRNA DGCR5组AGS细胞A值、克隆数、划痕愈合率、迁移数和侵袭数及MMP2和MMP9蛋白表达量均降低（P均< 0.05）。与高剂量+si-NC组比较，高剂量+si-lncRNA DGCR5组A值、克隆数、划痕愈合率、迁移和侵袭数及MMP2、MMP9蛋白表达增高（P均< 0.05）。

结论

普鲁卡因可能提高lncRNA DGCR5表达来阻碍胃癌AGS细胞的迁移、侵袭和增殖。

关键词: 普鲁卡因, 胃癌, lncRNA DGCR5, 细胞增殖, 迁移, 侵袭

Objective

To explore procaine's role and potential mechanism in the migration, invasion and proliferation of gastric cancer cells.

Methods

Gastric cancer AGS cells were divided into low, medium, and high dose of procaine groups (cells were cultured in medium containing 3, 6, 12 mmol/L procaine for 24 h) , pcDNA-lncRNA DGCR5 group (AGS cells transfected with lncRNA DGCR5 overexpression vector were cultured in the conventional medium for 24 h) , pcDNA-NC group (AGS cells transfected with empty vector were cultured in the conventional medium for 24 h) , high-dose+si-lncRNA DGCR5 group (AGS cells transfected with lncRNA DGCR5 small interfering RNA were cultured in medium containing 12 mmol/L procaine for 24 h) , high-dose+si-NC group (AGS cells transfected with out-of-order nonsense negative sequence were cultured in medium containing 12 mmol/L procaine for 24 h) , and control group (AGS cells were cultured in conventional medium for 24 h) . And then, MTT, clone formation, scratch healing, Transwell and Western blot method were used to detect cell proliferation, migration and invasion, and the protein expression of MMP2 and MMP9 in cells, respectively; RT-qPCR was used to detected the expression of lncRNA DGCR5. Independent sample t-test was used for comparison between two groups, and univariate analysis of variance and LSD-t test were used for comparison between multiple groups.

Results

Compared with the control group, the A value, clone count, scratch healing rate, the number of migration and invasion of AGS cells, and the protein expression of MMP2 and MMP9 in the low, medium and high dose groups of procaine were decreased (P all < 0.05) , and the expression of lncRNA DGCR5 (1.69 ± 0.13, 2.18 ± 0.17, 2.49 ± 0.15 vs 1.00 ± 0.10) was increased (P < 0.05) . Compared with the pcDNA-NC group, the A value, clone count, scratch healing rate, the number of migration and invasion of AGS cells, and the protein expression of MMP2 and MMP9 in the pcDNA-lncRNA DGCR5 group were all decreased (P all < 0.05) . Compared with the high-dose+si-NC group, the A value, clone count, scratch healing rate, the number of migration and invasion of AGS cells, and the protein expression of MMP2 and MMP9 in the pcDNA-lncRNA DGCR5 group were all increased (P all < 0.05) .

Conclusion

Procaine may inhibit the migration, invasion proliferation and gastric cancer AGS cells by increasing the expression of lncRNA DGCR5.

Key words: Procaine, Gastric cancer, lncRNA DGCR5, Cell proliferation, Migration, Invasion

表1 引物序列信息

基因	序列（5'→3'）	预期扩增产物长度（bp）
lncRNA DGCR5	上游CACGAGTGTAGTGCCCAGTT	75
	下游GGTCAGGGACCTTTGTCGTT
β-actin	上游AAGTACTCCGTGTGGATCGG	136
	下游ATGCTATCACCTCCCCTGTG

表1 引物序列信息

基因	序列（5'→3'）	预期扩增产物长度（bp）
lncRNA DGCR5	上游CACGAGTGTAGTGCCCAGTT	75
	下游GGTCAGGGACCTTTGTCGTT
β-actin	上游AAGTACTCCGTGTGGATCGG	136
	下游ATGCTATCACCTCCCCTGTG

图1 不同浓度普鲁卡因对AGS细胞克隆形成的影响（结晶紫染色）注：a图为对照组，b图为低剂量组，c图为中剂量组，d图为高剂量组

表2 不同浓度普鲁卡因抑制AGS细胞增殖活性（

± s，n = 9）

分组	A值	克隆数（个）
对照组	1.14 ± 0.10	163.45 ± 9.87
低剂量组	0.98 ± 0.08^a	121.63 ± 8.43^a
中剂量组	0.77 ± 0.06^ab	93.87 ± 6.96^ab
高剂量组	0.60 ± 0.05^abc	72.65 ± 5.68^abc
F值	89.533	222.182
P值	< 0.001	< 0.001

表2 不同浓度普鲁卡因抑制AGS细胞增殖活性（

± s，n = 9）

分组	A值	克隆数（个）
对照组	1.14 ± 0.10	163.45 ± 9.87
低剂量组	0.98 ± 0.08^a	121.63 ± 8.43^a
中剂量组	0.77 ± 0.06^ab	93.87 ± 6.96^ab
高剂量组	0.60 ± 0.05^abc	72.65 ± 5.68^abc
F值	89.533	222.182
P值	< 0.001	< 0.001

图2 光学显微镜下观察AGS细胞经普鲁卡因干预后的迁移和侵袭情况（结晶紫染色，×200）

图3 光学显微镜下观察不同浓度普鲁卡因对AGS细胞划痕愈合的影响（×40）

图4 Western blot检测AGS细胞经普鲁卡因干预后细胞中MMP2、MMP9蛋白表达

表3 普鲁卡因对AGS细胞迁移和侵袭的抑制作用（

± s，n = 9）

分组	MMP2	MMP9	细胞迁移数量（个）	细胞侵袭数量（个）	划痕愈合率（%）
对照组	0.85 ± 0.07	0.79 ± 0.06	243.49 ± 15.42	187.36 ± 13.24	98.74 ± 2.56
低剂量组	0.69 ± 0.05^a	0.71 ± 0.07^a	216.73 ± 13.16^a	153.41 ± 9.16^a	86.43 ± 5.14^a
中剂量组	0.49 ± 0.03^ab	0.58 ± 0.04^ab	173.42 ± 12.04^ab	116.98 ± 6.13^ab	72.59 ± 4.71^ab
高剂量组	0.37 ± 0.02^abc	0.41 ± 0.03^abc	136.09 ± 8.39^abc	84.26 ± 3.79^abc	57.62 ± 2.93^abc
F/F'值	F' = 187.034	90.191	129.006	F' = 230.585	177.522
P值	< 0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001

表3 普鲁卡因对AGS细胞迁移和侵袭的抑制作用（

± s，n = 9）

分组	MMP2	MMP9	细胞迁移数量（个）	细胞侵袭数量（个）	划痕愈合率（%）
对照组	0.85 ± 0.07	0.79 ± 0.06	243.49 ± 15.42	187.36 ± 13.24	98.74 ± 2.56
低剂量组	0.69 ± 0.05^a	0.71 ± 0.07^a	216.73 ± 13.16^a	153.41 ± 9.16^a	86.43 ± 5.14^a
中剂量组	0.49 ± 0.03^ab	0.58 ± 0.04^ab	173.42 ± 12.04^ab	116.98 ± 6.13^ab	72.59 ± 4.71^ab
高剂量组	0.37 ± 0.02^abc	0.41 ± 0.03^abc	136.09 ± 8.39^abc	84.26 ± 3.79^abc	57.62 ± 2.93^abc
F/F'值	F' = 187.034	90.191	129.006	F' = 230.585	177.522
P值	< 0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001

图5 普鲁卡因对AGS细胞中lncRNA DGCR5表达的影响（n = 9）注：与对照组比较，^aP < 0.05；与低剂量组比较，^bP < 0.05；与中剂量组比较，^cP < 0.05；n为样本量

图6 光学显微镜下观察过表达lncRNA DGCR5的AGS细胞迁移和侵袭情况（结晶紫染色，×200）

图7 光学显微镜下观察过表达lncRNA DGCR5对AGS细胞克隆形成（结晶紫染色）和划痕愈合（×40）的影响

图8 Western blot检测过表达lncRNA DGCR5后AGS细胞中MMP2、MMP9蛋白表达

表4 过表达lncRNA　DGCR5对AGS细胞增殖、迁移和侵袭的影响（

± s，n = 9）

分组	lncRNA DGCR5	A值	克隆数（个）	MMP2
pcDNA-NC	1.00 ± 0.09	1.13 ± 0.08	161.69 ± 5.12	0.84 ± 0.06
pcDNA-lncRNA DGCR5	2.87 ± 0.18	0.65 ± 0.05	80.47 ± 3.53	0.35 ± 0.02
t/t'值	27.876	15.264	39.180	t' = 23.243
P值	< 0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001
分组	MMP9	细胞迁移数量（个）	细胞侵袭数量（个）	划痕愈合率（%）
pcDNA-NC	0.80 ± 0.07	248.12 ± 12.16	181.36 ± 10.41	97.89 ± 2.09
pcDNA-lncRNA DGCR5	0.40 ± 0.03	138.45 ± 7.01	101.27 ± 4.61	64.75 ± 4.02
t/t’值	t' = 15.757	23.441	t' = 21.104	21.943
P值	< 0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001

表4 过表达lncRNA　DGCR5对AGS细胞增殖、迁移和侵袭的影响（

± s，n = 9）

分组	lncRNA DGCR5	A值	克隆数（个）	MMP2
pcDNA-NC	1.00 ± 0.09	1.13 ± 0.08	161.69 ± 5.12	0.84 ± 0.06
pcDNA-lncRNA DGCR5	2.87 ± 0.18	0.65 ± 0.05	80.47 ± 3.53	0.35 ± 0.02
t/t'值	27.876	15.264	39.180	t' = 23.243
P值	< 0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001
分组	MMP9	细胞迁移数量（个）	细胞侵袭数量（个）	划痕愈合率（%）
pcDNA-NC	0.80 ± 0.07	248.12 ± 12.16	181.36 ± 10.41	97.89 ± 2.09
pcDNA-lncRNA DGCR5	0.40 ± 0.03	138.45 ± 7.01	101.27 ± 4.61	64.75 ± 4.02
t/t’值	t' = 15.757	23.441	t' = 21.104	21.943
P值	< 0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001

图9 Western Blot检测普鲁卡因对敲减lncRNA DGCR5的AGS细胞中MMP2、MMP9蛋白表达表达的影响

图10 光学显微镜下观察普鲁卡因对lncRNA DGCR5敲减的AGS细胞侵袭和迁移的影响（结晶紫染色，×200）

图11 光学显微镜下观察过表达lncRNA DGCR5对AGS细胞克隆形成（结晶紫染色）和划痕愈合（×40）的影响

表5 敲减lncRNA DGCR5逆转普鲁卡因对AGS细胞增殖、迁移和侵袭的影响（

± s，n = 9）

分组	lncRNA DGCR5	A值	克隆数（个）	MMP2
高剂量+si-NC组	1.00 ± 0.08	0.61 ± 0.04	70.95 ± 4.68	0.35 ± 0.03
高剂量+si-lncRNA DGCR5组	0.48 ± 0.03	1.11 ± 0.09	132.14 ± 5.43	0.87 ± 0.07
t/t'值	t' = 18.258	t' =15.230	25.608	t' = 20.484
P值	< 0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001
分组	MMP9	细胞迁移数量（个）	细胞侵袭数量（个）	划痕愈合率（%）
高剂量+si-NC组	0.43 ± 0.03	132.15 ± 5.47	81.24±2.49	55.78 ± 2.41
高剂量+si-lncRNA DGCR5组	0.76 ± 0.05	243.06 ± 1.24	163.31±2.76	83.67 ± 3.62
t/t'值	16.978	t'=59.323	66.235	19.240
P值	< 0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001

表5 敲减lncRNA DGCR5逆转普鲁卡因对AGS细胞增殖、迁移和侵袭的影响（

± s，n = 9）

分组	lncRNA DGCR5	A值	克隆数（个）	MMP2
高剂量+si-NC组	1.00 ± 0.08	0.61 ± 0.04	70.95 ± 4.68	0.35 ± 0.03
高剂量+si-lncRNA DGCR5组	0.48 ± 0.03	1.11 ± 0.09	132.14 ± 5.43	0.87 ± 0.07
t/t'值	t' = 18.258	t' =15.230	25.608	t' = 20.484
P值	< 0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001
分组	MMP9	细胞迁移数量（个）	细胞侵袭数量（个）	划痕愈合率（%）
高剂量+si-NC组	0.43 ± 0.03	132.15 ± 5.47	81.24±2.49	55.78 ± 2.41
高剂量+si-lncRNA DGCR5组	0.76 ± 0.05	243.06 ± 1.24	163.31±2.76	83.67 ± 3.62
t/t'值	16.978	t'=59.323	66.235	19.240
P值	< 0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001

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Procaine inhibits the proliferation, migration and invasion of gastric cancer cells through up-regulating lncRNA DGCR5

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