干扰LINC00466通过miR-493-3p/MIF抑制子宫内膜癌RL95-2细胞恶性生物学行为

doi:10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2023.03.004

目的

探讨LINC00466对子宫内膜癌RL95-2细胞生物学行为的影响及其作用机制。

方法

收集43例子宫内膜癌患者癌组织和癌旁组织，qRT-PCR法检测组织中LINC00466和miR-493-3p表达。体外培养RL95-2细胞，转染LINC00466小干扰RNA或miR-493-3p模拟物、或共转染LINC00466小干扰RNA与miR-493-3p抑制剂后，CCK-8法、Transwell实验分别检测细胞增殖抑制率、迁移和侵袭，qRT-PCR和Western blot分别检测细胞中巨噬细胞移动抑制因子（MIF） mRNA和蛋白表达。双荧光素酶报告基因实验对LINC00466和miR-493-3p调控关系进行验证。两组间比较采用t检验。

结果

子宫内膜癌组织中LINC00466的表达量较癌旁组织（2.66±0.34比0.95±0.21）升高，miR-493-3p的表达量较癌旁组织（0.42±0.10比0.98±0.15）降低，差异有统计学意义（P均< 0.001）。干扰LINC00466或过表达miR-493-3p增加RL95-2细胞增殖抑制率，减少细胞迁移数、侵袭数及细胞中MIF mRNA和蛋白表达（P < 0.001）。LINC00466靶向结合miR-493-3p，且干扰LINC00466的RL95-2细胞中miR-493-3p表达增加。敲减miR-493-3p逆转干扰LINC00466对RL95-2细胞增殖、迁移和侵袭及MIF表达的影响。

结论

LINC00466在子宫内膜癌组织中表达上调，干扰LINC00466可能通过靶向上调miR-493-3p和阻碍MIF表达来抑制子宫内膜癌RL95-2细胞增殖、迁移和侵袭。

关键词: 子宫内膜癌, LINC00466, miR-493-3p, 巨噬细胞移动抑制因子, 细胞增殖, 迁移, 侵袭

Objective

To investigate the effect of LINC00466 on the biological behavior of endometrial cancer RL95-2 cells and its mechanism.

Methods

The cancer tissues and adjacent tissues of 43 patients with endometrial cancer were collected, and the expression of LINC00466 and miR-493-3p in the tissues were detected by qRT-PCR. RL95-2 cells were cultured in vitro and transfected with LINC00466 small interfering RNA or miR-493-3p mimic, or co-transfected with LINC00466 small interfering RNA and miR-493-3p inhibitor, and then CCK-8 method and Transwell assay were used to detect cell proliferation inhibition rate, migration and invasion. qRT-PCR and Western blot were used to detect the mRNA and protein expression of macrophage migration inhibitory factor (MIF) in cells, respectively. The regulatory relationship between LINC00466 and miR-493-3p was verified by the dual-luciferase reporter gene experiment. Comparison between the two groups was performed by t test.

Results

The expression of LINC00466 in endometrial cancer tissues was higher than that in adjacent tissues (2.66 ± 0.34 vs 0.95 ± 0.21) , but the expression of miR-493-3p was lower than that in adjacent tissues (0.42 ± 0.10 vs 0.98 ± 0.15) , and the differences were statistically significant (both P < 0.001) . Interfering with LINC00466 or overexpressing miR-493-3p increased the proliferation inhibition rate of RL95-2 cells, but decreased the number of cell migration and invasion and the mRNA and protein expression of MIF in cells (P < 0.001) . LINC00466 targets miR-493-3p, and the expression of miR-493-3p was increased in RL95-2 cells that interfered with LINC00466. Knockdown of miR-493-3p reversed the effects of interfering with LINC00466 on proliferation, migration, invasion and the expression of MIF in RL95-2 cells.

Conclusion

The expression of LINC00466 was up-regulated in endometrial cancer tissues. Interfering with LINC00466 may inhibit the proliferation, migration and invasion of endometrial cancer RL95-2 cells by targeting up-regulation of miR-493-3p and blocking MIF expression.

Key words: Endometrial cancer, LINC00466, miR-493-3p, Macrophage migration inhibitor, Cell proliferation, Migration, Invasion

表1 引物序列信息

基因	引物序列（5'→3'）	预期扩增长度（bp）
LINC00466	上游AGCCCTTCCGTCTTGTTACG	256
	下游GCTTCCCAACTGCAGGTTTC
MIF mRNA	上游GCACAGCATCGGCAAGAT	134
	下游GAGTTGTTCCAGCCCACATT
GAPDH	上游CGTATTGGGCGCCTGGTCACCAG	117
	下游GTTGTCATGGATGACCTTGGCCAG
miR-493-3p	上游GCCGAGTGAAGGTCTACTGTGT	189
	下游CTCAACTGGTGTCGTGGA
U6	上游CTCGCTTCGGCAGCACATATACT	95
	下游ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC

表1 引物序列信息

基因	引物序列（5'→3'）	预期扩增长度（bp）
LINC00466	上游AGCCCTTCCGTCTTGTTACG	256
	下游GCTTCCCAACTGCAGGTTTC
MIF mRNA	上游GCACAGCATCGGCAAGAT	134
	下游GAGTTGTTCCAGCCCACATT
GAPDH	上游CGTATTGGGCGCCTGGTCACCAG	117
	下游GTTGTCATGGATGACCTTGGCCAG
miR-493-3p	上游GCCGAGTGAAGGTCTACTGTGT	189
	下游CTCAACTGGTGTCGTGGA
U6	上游CTCGCTTCGGCAGCACATATACT	95
	下游ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC

图1 子宫内膜癌组织中LINC00466和miR-493-3p表达注：^aP < 0.001

图2 倒置显微镜下观察干扰LINC00466对RL95-2细胞迁移和侵袭的影响（结晶紫染色，×200）注：a、c图为si-NC组细胞的迁移和侵袭结果；b、d图为si-LINC00466组细胞的迁移和侵袭结果，可见被染色的细胞数与si-NC组相比减少

表2 干扰LINC00466对RL95-2细胞增殖、迁移和侵袭的影响（ ± s）

分组	实验次数	LINC00466	抑制率（%）	迁移数（个）	侵袭数（个）
si-NC	3	1.00 ± 0.06	0.02 ± 0.01	166.44 ± 11.71	134.56 ± 9.03
si-LINC00466	3	0.27 ± 0.03	42.58 ± 1.25	84.78 ± 3.39	69.67 ± 3.20
t/t'值		t’= 32.647	t’= 96.474	t’= 18.946	19.155
P值		< 0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001

表2 干扰LINC00466对RL95-2细胞增殖、迁移和侵袭的影响（ ± s）

分组	实验次数	LINC00466	抑制率（%）	迁移数（个）	侵袭数（个）
si-NC	3	1.00 ± 0.06	0.02 ± 0.01	166.44 ± 11.71	134.56 ± 9.03
si-LINC00466	3	0.27 ± 0.03	42.58 ± 1.25	84.78 ± 3.39	69.67 ± 3.20
t/t'值		t’= 32.647	t’= 96.474	t’= 18.946	19.155
P值		< 0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001

图3 LINC00466靶向结合miR-493-3p注：a图为预测的LINC00466和miR-493-3p的互补序列；b图为验证LINC00466和miR-493-3p靶向关系的双荧光素酶结果；^aP < 0.001；ns为差异无统计学意义

图4 干扰LINC00466促进RL95-2细胞中miR-493-3p表达而抑制MIF表达注：a图为miR-493-3p的表达量；b图为MIF mRNA相对表达量；c图为干扰LINC00466对RL95-2细胞中MIF蛋白表达的影响；^aP < 0.05

图5 倒置显微镜下观察过表达miR-493-3p对RL95-2细胞迁移、侵袭的影响（结晶紫染色，×200）注：a、c图为miR-NC组细胞的迁移和侵袭结果；b、d图为miR-493-3p组细胞的迁移和侵袭结果，可见被染色的细胞数与miR-NC组相比减少

表3 过表达miR-493-3p对RL95-2细胞增殖、迁移、侵袭的影响（ ± s）

分组	实验次数	miR-493-3p	抑制率（%）	迁移数（个）	侵袭数（个）
miR-NC	3	0.99 ± 0.05	0.03 ± 0.01	166.78 ± 7.67	136.22 ± 6.07
miR-493-3p	3	2.39 ± 0.10	35.81 ± 1.31	95.89 ± 3.78	83.56 ± 3.72
t/t'值		37.566	t' = 77.107	t' = 23.441	20.933
P值		< 0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001

表3 过表达miR-493-3p对RL95-2细胞增殖、迁移、侵袭的影响（ ± s）

分组	实验次数	miR-493-3p	抑制率（%）	迁移数（个）	侵袭数（个）
miR-NC	3	0.99 ± 0.05	0.03 ± 0.01	166.78 ± 7.67	136.22 ± 6.07
miR-493-3p	3	2.39 ± 0.10	35.81 ± 1.31	95.89 ± 3.78	83.56 ± 3.72
t/t'值		37.566	t' = 77.107	t' = 23.441	20.933
P值		< 0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001

图6 过表达miR-493-3p对RL95-2细胞中MIF表达的影响注：a图为MIF mRNA相对表达量；b图为MIF蛋白表达条带图和蛋白表达量；^aP < 0.001

图7 倒置显微镜下观察敲减miR-493-3p逆转干扰LINC00466对RL95-2细胞迁移、侵袭的影响（结晶紫染色，×200）注：a、c图为si-LINC00466+anti-miR-NC组细胞的迁移和侵袭结果；b、d图为si-LINC00466+anti-miR-493-3p组细胞的迁移和侵袭结果，可见被染色的细胞数与si-LINC00466+anti-miR-NC组相比增多

图8 敲减miR-493-3p逆转干扰LINC00466对RL95-2细胞增殖、迁移、侵袭及MIF表达的影响注：a图为miR-493-3p相对表达量；b图为细胞抑制率；c图为细胞迁移数；d图为细胞侵袭数；e图为MIF mRNA相对表达量；f图为MIF蛋白表达条带图和蛋白表达量；^aP < 0.001

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Interference with LINC00466 inhibits the malignant biological behavior of endometrial cancer RL95-2 cells through miR-493-3p/MIF

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