南蛇藤素调节SDF-1/CXCR4信号通路对脂多糖诱导的A549细胞损伤的影响

doi:10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2023.03.003

目的

分析南蛇藤素对脂多糖（LPS）诱导的肺泡上皮细胞损伤的影响以及基质细胞衍生因子-1 （SDF-1）/趋化因子受体4 （CXCR4）通路在其中发挥的作用。

方法

培养人肺泡Ⅱ型上皮细胞系A549细胞，用浓度为10 μg/mL LPS处理24 h，并在LPS处理前用终浓度为25、100 mmol/L的南蛇藤素或100 mmol/L的南蛇藤素与100 μg/mL的AMD3100 （CXCR4抑制剂）处理2 h。CCK-8法测定A549细胞活力，TUNEL法测定A549细胞凋亡，试剂盒法测定A549细胞培养上清液中乳酸脱氢酶（LDH）含量，ELISA法检测A549细胞肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素6 （IL-6）、IL-10水平，Western blot法测定SDF-1、CXCR4蛋白表达。多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q法进行。

结果

与对照组相比，LPS组A549细胞TUNEL阳性率[（65.78 ± 8.21）%比（4.23 ± 0.77）%]、细胞凋亡率[（21.38 ± 2.70）%比（7.64 ± 0.95）%]、cleaved caspase-3、Bax蛋白、LDH、TNF-α、IL-6、SDF-1 （2.02 ± 0.25比0.75 ± 0.10）、CXCR4蛋白（1.59 ± 0.19比0.71 ± 0.08）升高（P < 0.05），存活率、Bcl-2蛋白、IL-10表达降低（P < 0.05）；与LPS组相比，LPS+南蛇藤素低剂量组、LPS+南蛇藤素高剂量组A549细胞TUNEL阳性率[（52.51 ± 6.54）%，（41.37 ± 5.17）%比（65.78 ± 8.21）%]、细胞凋亡率[（17.62 ± 2.45）%，（12.37 ± 1.54）%比（21.38 ± 2.70）%]、cleaved caspase-3、Bax蛋白、LDH、TNF-α、IL-6、SDF-1 （1.69 ± 0.20，1.32 ± 0.18比2.02 ± 0.25）、CXCR4蛋白（1.05 ± 0.13，1.31 ± 0.16比1.59 ± 0.19）降低，存活率、Bcl-2蛋白和IL-10表达升高（P < 0.05）；与LPS+南蛇藤素高剂量组相比，LPS+南蛇藤素高剂量+AMD3100组A549细胞TUNEL阳性率[（24.28 ± 4.28）%比（41.37 ± 5.17）%]、细胞凋亡率[（9.91 ± 1.25）%比（12.37 ± 1.54）%]、cleaved caspase-3、Bax蛋白、LDH、TNF-α、IL-6、SDF-1 （0.95 ± 0.13比1.32 ± 0.18）、CXCR4蛋白（0.78 ± 0.09比1.05 ± 0.13）降低，存活率、Bcl-2蛋白和IL-10表达升高（P < 0.05）。

结论

南蛇藤素可降低LPS诱导的A549细胞凋亡与炎症，提高细胞存活，其作用机制可能与抑制SDF-1/CXCR4通路有关。

关键词: 南蛇藤素, SDF-1, CXCR4, A549细胞

Objective

To analyze the influence of Celastrol on lipopolysaccharide (LPS) -induced alveolar epithelial cell injury and the role of stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) /chemokine receptor 4 (CXCR4) pathway in it.

Methods

Human alveolar type Ⅱ epithelial cell line A549 cells were cultured and treated with 10 μg/mL LPS for 24 h. Before LPS treatment, treat them with final concentrations of 25 mmol/L, 100 mmol/L of celastrol or 100 mmol/L of celastrol and 100 μg/L of AMD3100 (CXCR4 inhibitor) for 2 hours. The viability of A549 cells was determined by the CCK-8 method, apoptosis of A549 cells was measured by the TUNEL method, the LDH of A549 cells was determined by kits, the levels of tumor necrosis factor (TNF) -α, interleukin-6 (IL-6) and IL-10 in A549 cells were detected by ELISA, and the expression of SDF-1 and CXCR4 protein were as detected by Western blot. One-way analysis of variance was used for statistical comparison among multiple groups, and the SNK-q method was used for further pairwise statistical comparison.

Results

Compared with the control group, the positive rate of TUNEL [ (65.78 ± 8.21) % vs (4.23 ± 0.77) %], the apoptosis rate [ (21.38 ± 2.70) %vs (7.64 ± 0.95) %], cleaved caspase-3, Bax protein, LDH, TNF-α, IL-6, SDF-1 (2.02 ± 0.25 vs 0.75 ± 0.10) , and CXCR4 (1.59 ± 0.19 vs 0.71 ± 0.08) protein were increased in A549 cells in LPS group (P < 0.05) , and the survival rate, Bcl-2 protein and IL-10 expression decreased (P < 0.05) ; compared with the LPS group, the positive rate of TUNEL [ (52.51 ± 6.54) %, (41.37 ± 5.17) %vs (65.78 ± 8.21) %], the apoptosis rate was [ (17.62 ± 2.45) %, (12.37 ± 1.54) %vs (21.38 ± 2.70) %], cleaved caspase-3, Bax protein, LDH, TNF-α, IL-6, SDF-1 (1.69 ± 0.20, 1.32 ± 0.18 vs 2.02 ± 0.25) , CXCR4 (1.31 ± 0.16, 1.05 ± 0.13 vs 1.59 ± 0.19) protein in A549 cells in the low-dose Celastrol group and high-dose Celastrol group significantly reduced, and the survival rate, Bcl-2 protein and IL-10 expression significantly increased (P < 0.05) ; compared with the high-dose Celastrol group, the positive rate of TUNEL[ (24.28 ± 4.28) %vs (41.37 ± 5.17) %], the apoptosis rate [ (9.91 ± 1.25) %vs (12.37 ± 1.54) %], and cleaved caspase-3, Bax protein, LDH, TNF-α, IL-6, SDF-1 (0.95 ± 0.13 vs 1.32 ± 0.18) , and CXCR4 (0.78 ± 0.09 vs 1.05 ± 0.13) protein of A549 cells in the high-dose Celastrol + AMD3100 group decreased, and the survival rate, Bcl-2 protein and IL-10 expression significantly increased (P < 0.05) .

Conclusion

Celastrol can reduce LPS-induced apoptosis and inflammation of A549 cells and improve cell survival, which may be related to the inhibition of the SDF-1/CXCR4 pathway.

Key words: Celastrol, SDF-1, CXCR4, Alveolar epithelial cells

表1 A549细胞存活率比较（ ± s）

分组	实验次数	细胞存活率（%）
对照	3	100
LPS	3	32.35 ± 4.01^a
LPS+南蛇藤素低剂量	3	43.57 ± 5.44^b
LPS+南蛇藤素高剂量	3	55.34 ± 6.86^bc
LPS+南蛇藤素高剂量+AMD3100	3	62.71 ± 7.82^d
H值		26.175
P值		< 0.001

表1 A549细胞存活率比较（ ± s）

分组	实验次数	细胞存活率（%）
对照	3	100
LPS	3	32.35 ± 4.01^a
LPS+南蛇藤素低剂量	3	43.57 ± 5.44^b
LPS+南蛇藤素高剂量	3	55.34 ± 6.86^bc
LPS+南蛇藤素高剂量+AMD3100	3	62.71 ± 7.82^d
H值		26.175
P值		< 0.001

图1 荧光显微镜下观察A549细胞凋亡（TUNEL染色，×200）注：a、b图为对照组、LPS组A549细胞TUNEL阳性染色结果，可见TUNEL阳性细胞与对照组相比增多；c、d为LPS+南蛇藤素低剂量组、LPS+南蛇藤素高剂量组A549细胞TUNEL阳性染色结果，可见TUNEL阳性细胞与LPS组相比减少；e为LPS+南蛇藤素高剂量+AMD3100组A549细胞TUNEL阳性染色结果，可见TUNEL阳性细胞与LPS+南蛇藤素高剂量组相比减少

图2 流式细胞术观察A549细胞凋亡注：a图为对照组；b图为LPS组，可见细胞凋亡率与对照组相比增加；c、d图为LPS+南蛇藤素低剂量组、LPS+南蛇藤素高剂量组，可见细胞凋亡率与LPS组相比降低；e为LPS+南蛇藤素高剂量+AMD3100组，可见细胞凋亡率与LPS+南蛇藤素高剂量组相比降低

图3 Western blot检测A549细胞cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表达

表2 A549细胞TUNEL阳性率、cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表达比较（ ± s，n = 3）

分组	TUNEL阳性率（%）	细胞凋亡率（%）	cleaved caspase-3/GAPDH	Bcl-2/GAPDH	Bax/GAPDH
对照	4.23 ± 0.77	7.64 ± 0.95	0.56 ± 0.07	0.92 ± 0.11	1.24 ± 0.15
LPS	65.78 ± 8.21^a	21.38 ± 2.70^a	1.37 ± 0.17^a	0.21 ± 0.03^a	2.38 ± 0.26^a
LPS+南蛇藤素低剂量	52.51 ± 6.54^b	17.62 ± 2.45^b	1.02 ± 0.12^b	0.35 ± 0.03^b	1.95 ± 0.20^b
LPS+南蛇藤素高剂量	41.37 ± 5.17^bc	12.37 ± 1.54^bc	0.77 ± 0.10^bc	0.49 ± 0.05^bc	1.64 ± 0.17^bc
LPS+南蛇藤素高剂量+AMD3100	24.28 ± 4.28^d	9.91 ± 1.25^d	0.49 ± 0.08^d	0.62 ± 0.06^d	1.30 ± 0.16^d
H/F值	H = 27.133	H = 26.725	F = 60.264	H = 27.685	F = 36.568
P值	< 0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001

表2 A549细胞TUNEL阳性率、cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表达比较（ ± s，n = 3）

分组	TUNEL阳性率（%）	细胞凋亡率（%）	cleaved caspase-3/GAPDH	Bcl-2/GAPDH	Bax/GAPDH
对照	4.23 ± 0.77	7.64 ± 0.95	0.56 ± 0.07	0.92 ± 0.11	1.24 ± 0.15
LPS	65.78 ± 8.21^a	21.38 ± 2.70^a	1.37 ± 0.17^a	0.21 ± 0.03^a	2.38 ± 0.26^a
LPS+南蛇藤素低剂量	52.51 ± 6.54^b	17.62 ± 2.45^b	1.02 ± 0.12^b	0.35 ± 0.03^b	1.95 ± 0.20^b
LPS+南蛇藤素高剂量	41.37 ± 5.17^bc	12.37 ± 1.54^bc	0.77 ± 0.10^bc	0.49 ± 0.05^bc	1.64 ± 0.17^bc
LPS+南蛇藤素高剂量+AMD3100	24.28 ± 4.28^d	9.91 ± 1.25^d	0.49 ± 0.08^d	0.62 ± 0.06^d	1.30 ± 0.16^d
H/F值	H = 27.133	H = 26.725	F = 60.264	H = 27.685	F = 36.568
P值	< 0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001

表3 A549细胞LDH比较（ ± s）

分组	例数	LDH（U/L）
对照	6	94.32 ± 11.75
LPS	6	561.67 ± 68.94^a
LPS+南蛇藤素低剂量	6	472.15 ± 54.01^ab
LPS+南蛇藤素高剂量	6	389.72 ± 49.96^abc
LPS+南蛇藤素高剂量+AMD3100	6	308.97 ± 44.83^abcd
F值		77.462
P值		< 0.001

表3 A549细胞LDH比较（ ± s）

分组	例数	LDH（U/L）
对照	6	94.32 ± 11.75
LPS	6	561.67 ± 68.94^a
LPS+南蛇藤素低剂量	6	472.15 ± 54.01^ab
LPS+南蛇藤素高剂量	6	389.72 ± 49.96^abc
LPS+南蛇藤素高剂量+AMD3100	6	308.97 ± 44.83^abcd
F值		77.462
P值		< 0.001

表4 A549细胞TNF-α、IL-6、IL-10表达比较（ ± s）

分组	实验次数	TNF-α （pg/mL）	IL-6 （ng/L）	IL-10 （ng/L）
对照	3	51.82 ± 6.47	40.53 ± 5.06	59.82 ± 7.47
LPS	3	273.54 ± 31.08^a	87.32 ± 10.54^a	22.30 ± 2.78^a
LPS+南蛇藤素低剂量	3	216.94 ± 23.85^b	74.39 ± 9.53^b	31.28 ± 3.90^b
LPS+南蛇藤素高剂量	3	175.32 ± 19.91^bc	59.71 ± 7.42^bc	35.29 ± 4.41^bc
LPS+南蛇藤素高剂量+AMD3100	3	124.73 ± 15.52^d	45.85 ± 5.61^d	49.33 ± 5.41^d
H/F值		H = 26.994	F = 32.797	F = 52.407
P值		< 0.001	< 0.001	< 0.001

表4 A549细胞TNF-α、IL-6、IL-10表达比较（ ± s）

分组	实验次数	TNF-α （pg/mL）	IL-6 （ng/L）	IL-10 （ng/L）
对照	3	51.82 ± 6.47	40.53 ± 5.06	59.82 ± 7.47
LPS	3	273.54 ± 31.08^a	87.32 ± 10.54^a	22.30 ± 2.78^a
LPS+南蛇藤素低剂量	3	216.94 ± 23.85^b	74.39 ± 9.53^b	31.28 ± 3.90^b
LPS+南蛇藤素高剂量	3	175.32 ± 19.91^bc	59.71 ± 7.42^bc	35.29 ± 4.41^bc
LPS+南蛇藤素高剂量+AMD3100	3	124.73 ± 15.52^d	45.85 ± 5.61^d	49.33 ± 5.41^d
H/F值		H = 26.994	F = 32.797	F = 52.407
P值		< 0.001	< 0.001	< 0.001

图4 Western blot检测A549细胞SDF-1/CXCR4通路蛋白表达

表5 A549细胞SDF-1/CXCR4通路蛋白表达情况（ ± s）

分组	实验次数	SDF-1	CXCR4
对照	3	0.75 ± 0.10	0.71 ± 0.08
LPS	3	2.02 ± 0.25^a	1.59 ± 0.19^a
LPS+南蛇藤素低剂量	3	1.69 ± 0.20^b	1.31 ± 0.16^b
LPS+南蛇藤素高剂量	3	1.32 ± 0.18^bc	1.05 ± 0.13^bc
LPS+南蛇藤素高剂量+AMD3100	3	0.95 ± 0.13^d	0.78 ± 0.09^d
F值		50.308	43.540
P值		< 0.001	< 0.001

表5 A549细胞SDF-1/CXCR4通路蛋白表达情况（ ± s）

分组	实验次数	SDF-1	CXCR4
对照	3	0.75 ± 0.10	0.71 ± 0.08
LPS	3	2.02 ± 0.25^a	1.59 ± 0.19^a
LPS+南蛇藤素低剂量	3	1.69 ± 0.20^b	1.31 ± 0.16^b
LPS+南蛇藤素高剂量	3	1.32 ± 0.18^bc	1.05 ± 0.13^bc
LPS+南蛇藤素高剂量+AMD3100	3	0.95 ± 0.13^d	0.78 ± 0.09^d
F值		50.308	43.540
P值		< 0.001	< 0.001

1	Liu S, Gao S, Yang Z, et al. miR-128-3p reduced acute lung injury induced by sepsis via targeting PEL12[J]. Open Med(Wars), 2021, 16(1):1109-1120.
2	Liu Y, Wang X, Li P, et al. Targeting MALAT1 and miRNA-181a-5p for the intervention of acute lung injury/acute respiratory distress syndrome[J]. Respir Res, 22(1):1. doi: 10.1186/s12931-020-01578-8.
3	李峰, 王罡艳, 陶薪吉. 细胞因子信号转导抑制因子1对肺炎链球菌感染的肺泡上皮细胞A549损伤的影响[J]. 安徽医药, 2021, 25(11):2205-2209.
4	任献青, 鲁静, 孟祥乐,等. 雷公藤红素药理作用最新研究进展[J]. 中华中医药杂志, 2013, 28(9):2679-2682.
5	Li N, Chen C, Zhu H, et al. Discovery of novel celastrol-triazole derivatives with Hsp90-Cdc37 disruption to induce tumor cell apoptosis[J]. BioorgChem, 2021, 111:104867. doi: 10.1016/j.bioorg.2021.104867.
6	Stoicov C, Li H, L J, et al. Mesenchymal Stem Cells Utilize CXCR4–SDF-1 Signaling for Acute, but Not Chronic, Trafficking to Gastric Mucosal Inflammation[J]. Dig Dis Sci, 2013, 58(9):2466-2477.
7	赵晓勇, 孙美艳, 丁倩,等. NaHS干预SDF-1/CXCR4对休克大鼠肺损伤的影响[J]. 现代生物医学进展, 2016, 16(20):3822-3825.
8	亓水芹, 冯向功, 王慧琴. miR-194靶向FoxA1基因对LPS诱导的肺泡上皮细胞损伤影响[J]. 免疫学杂志, 2020, 36(3):193-200.
9	李嘉琪, 石艺, 钟燕,等. 南蛇藤素通过调控PTEN/Akt/Raf-1信号通路增强乳腺癌细胞对环磷酰胺的化疗敏感性[J]. 今日药学, 2021, 31(4):255-262.
10	陈聪, 赵雪强, 林云,等. CXCL12/CXCR4通路在人肺腺癌细胞诱导破骨细胞前体细胞向破骨细胞分化中的作用[J]. 山东医药, 2021, 61(29):10-13.
11	Pabalan Noel, Tharabenjasin P, Suntornsaratoon P, et al. Ethnic and age-specific acute lung injury/acute respiratory distress syndrome risk associated with angiotensin-converting enzyme insertion/deletion polymorphisms, implications for COVID-19: A meta-analysis[J]. Infect Genet Evol, 2020, 88:104682. doi: 10.1016/j.meegid.2020.104682.
12	Cui Y, Wang X, Lin F, et al. MiR-29a-3p Improves Acute Lung Injury by Reducing Alveolar Epithelial Cell PANoptosis[J]. Aging Dis, 2022, 13(3):899-909.
13	周航,李同林,宫帅. miR-1247-3p靶向SFTPC基因对LPS诱导的肺泡上皮细胞损伤的影响[J]. 中国煤炭工业医学杂志,2020,23(6):573-579.
14	尚立群,张永庆,苗毅,等. 过表达PGRN抑制LPS诱导的肺泡上皮细胞损伤[J]. 中国病理生理杂志,2017,33(5):877-883.
15	贾莹, 赵伟, 张欣媛,等. 南蛇藤醇抑制宫颈癌细胞生物学行为的机制研究[J]. 中国临床解剖学杂志, 2020, 38(4):421-427, 433.
16	高元喜, 张炜, 王玉霞,等. 南蛇藤醇介导的PTEN过表达增强顺铂对食管癌细胞的化学敏感性并抑制裸鼠成瘤能力[J]. 实验动物科学, 2020, 37(6):22-29.
17	余玲, 康倩, 刘葭,等. 雷公藤红素与吲哚美辛对脂多糖诱导的RAW264.7细胞的协同抗炎作用研究[J]. 中南药学, 2020, 18(11):1807-1813.
18	何招辉, 朱政, 杨小刚,等. 雷公藤红素通过抑制Toll样受体4/核转录因子-κB炎症通路减轻脓毒症诱导的大鼠急性肺损伤[J]. 中华危重病急救医学, 2021, 33(5):541-545.
19	赵楠, 穆春青, 王红,等. 雷公藤红素对A549肺癌细胞增殖及自噬的影响[J]. 锦州医科大学学报, 2020, 41(5):1-6.
20	张春阳, 李亮, 张宁坤. 气管植入间充质干细胞联合部分液体通气对海水淹溺致肺损伤大鼠治疗作用的研究[J]. 临床肺科杂志, 2021, 26(11):61680-1685.
21	唐志爱, 郭世燕, 黄建波. 丹参酮ⅡA通过激活SDF-1/CXCR4轴对大鼠急性心肌梗死的保护作用[J]. 实用药物与临床, 2020, 23(11):969-974.
22	张琪, 王琳, 李田洋,等. 基于SDF-1/CXCR4途径的骨炎消方体外干预对兔膝骨关节炎软骨组织的保护机制研究[J]. 中药药理与临床, 2021, 37(2):133-138.
23	Wang W, Ha C, Lin T, et al. Celastrol attenuates pain and cartilage damage via SDF-1/CXCR4 signalling pathway in osteoarthritis rats[J]. J Pharm Pharmacol, 2017, 70(1):81-88.

[1]	赵秀敏, 李杰, 彭洋颖, 姜健慧. 子宫腺肌病患者CXCL12/CXCR4/CXCR7 mRNA及其蛋白表达水平[J]. 中华妇幼临床医学杂志(电子版), 2020, 16(03): 309-315.
[2]	王亭婷, 严瑾, 郑英, 孔祥. CXCL12/CXCR4/CXCR7信号通路与妊娠及子痫前期发病机制研究[J]. 中华妇幼临床医学杂志(电子版), 2017, 13(02): 135-138.
[3]	罗皓天, 陈丹莹, 王伟财, 周晨. 基质细胞衍生因子1/CXC趋化因子受体4轴在骨免疫相关疾病中的研究进展[J]. 中华口腔医学研究杂志(电子版), 2023, 17(03): 218-227.
[4]	肖琪, 普彦淞, 都庆国, 段降龙, 李晓帆, 杨妮, 薛飞. SDF-1α基因多态性与西北地区汉族人群胃癌发病风险的相关性研究[J]. 中华普通外科学文献(电子版), 2021, 15(04): 258-262.
[5]	谭丹, 曾小琴, 徐伟, 陈戬, 周人杰. 姜黄素对肺癌A549细胞迁移和侵袭的影响[J]. 中华肺部疾病杂志(电子版), 2020, 13(03): 314-318.
[6]	龚年金, 李光才, 张明华, 刘培俊, 向悦华. lncRNA MAGI2-AS3下调miR-31-5p抑制肺腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭并促进凋亡[J]. 中华细胞与干细胞杂志(电子版), 2020, 10(04): 204-212.
[7]	董忱, 文瑞婷, 杨扬, 赵龙, 王丽, 段炼, 陈虎, 张斌. UM171和SR1对不同来源造血干/祖细胞体外扩增的作用研究[J]. 中华细胞与干细胞杂志(电子版), 2020, 10(02): 82-89.

阅读次数

全文

摘要

选择文件类型/文献管理软件名称

选择包含的内容

Influence of Celastrol on LPS-inducedA549 cells injury by regulating SDF-1/CXCR4 signaling pathway

模态框（Modal）标题

选择文件类型/文献管理软件名称

选择包含的内容

Influence of Celastrol on LPS-inducedA549 cells injury by regulating SDF-1/CXCR4 signaling pathway