二氯乙酸对人肾癌细胞株A498侵袭及迁移的抑制作用研究

doi:10.3877/cmj.j.issn.2095-1221.2020.01.005

目的

探讨二氯乙酸（DCA）对人肾癌细胞株A498侵袭及迁移的影响，并分析其机制。

方法

取人肾癌细胞株A498培养，分为阴性对照（等容积无菌生理盐水）组、DCA低、中、高（5、10、20 mmol/L）剂量组，培养48 h。Transwell小室实验检测侵袭能力，细胞划痕实验检测迁移能力，实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测c-Jun氨基末端激酶（JNK）、钙粘附蛋白E （E-cadherin）、N-钙粘蛋白（N-cadherin）基因表达，Western blot检测蛋白表达及磷酸化JNK （p-JNK）。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。

结果

与DCA高剂量组相比，DCA中、低剂量组、阴性对照组侵袭活性[（75.33 ± 10.09）比（167.89 ± 47.12）、（372.74 ± 50.06）、（530.26 ± 81.22）个/视野]、E-cadherin mRNA相对表达量（1.52 ± 0.12比1.35 ± 0.11、1.02 ± 0.11、0.85 ± 0.12）、E-cadherin蛋白相对表达量（1.32 ± 0.19比0.89 ± 0.14、0.37 ± 0.08、0.13 ± 0.03）均降低（P均< 0.001）；而迁移率[（10.05 ± 2.31）﹪比（23.95 ± 4.20）﹪、（36.26 ± 5.01）﹪、（53.59 ± 6.71）﹪]、N-cadherin mRNA蛋白相对表达量（0.42 ± 0.06比0.58 ± 0.07、0.80 ± 0.10、0.95 ± 0.11），N-cadherin蛋白相对表达量（0.15 ± 0.03比0.25 ± 0.04、0.74 ± 0.07、0.95 ± 0.11）、p-JNK水平（0.14 ± 0.03比0.29 ± 0.05、0.68 ± 0.07、0.95 ± 0.10）均升高（P均< 0.001）。不同剂量和阴性对照组的JNK mRNA与蛋白表达差异均无统计学意义（P > 0.05）。

结论

DCA可抑制人肾癌细胞株A498侵袭及迁移，且一定范围内呈剂量依赖性，推测与调控侵袭及迁移相关基因与蛋白表达有关。

关键词: 二氯乙酸, 肾癌, 侵袭, 迁移, 上皮间质转化

Objective

To investigate the effects and mechanisms of dichloroacetic acid (DCA) on the invasion and migration of the renal cell carcinoma cell line A498.

Methods

Human renal cell carcinoma cell line A498 were cultured and divided into negative a control (NC) group, a low dose DCA group, a medium dose DCA group and a high dose DCA group. The 3 dose groups of DCA were treated with 5, 10, 20 mmol/L DCA, and the NC group was administered isovolumetric sterile saline for 48 hours. Transwell chamber test was used to detect invasive ability and the cell scratch test to detect migration ability. Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction (qRT-PCR) was used to detect the expression of c-Jun amino-terminal kinase (JNK) , E-cadherin and N-cadherin genes. Western blot was used to detect the expressions of the above proteins and phosphorylated JNK (p-JNK) . The differences in the data of these groups were analyzed by one-way ANOVA in SPSS Statistics 25.0, and SNK-q test was used for comparison between each two groups.

Results

Comparing with high dose DCA group, the invasive activity decreased in the middle dose DCA group, the low dose DCA group and the negative control group (75.33±10.09 vs 167.89±47.12, 372.74±50.06 and 530.26±81.22/field) , and the relative expression of E-cadherin mRNA decreased (1.52±0.12 vs 1.35±0.11, 1.02±0.11 and 0.85±0.12, respectively) , as well as the relative expression of E-cadherin protein decreased (1.32±0.19 vs 0.89±0.14, 0.37±0.08 and 0.13±0.03, respectively) (all P< 0.001) , while the mobility[ (10.05±2.31) ﹪vs (23.95±4.20) ﹪, (36.26±5.01) ﹪ and (53.59±6.71) ﹪, respectively], the relative expression of N-cadherin mRNA (0.42±0.06 vs 0.58±0.07, 0.80±0.10 and 0.95±0.11, respectively) , the relative expression of N-cadherin protein (0.15±0.03 vs 0.25±0.04, 0.74±0.07 and 0.95±0.11, respectively) , and level of p-JNK (0.14±0.03 vs 0.29±0.05, 0.68±0.07 and 0.95±0.10, respectively) were increased (all P< 0.001) . There was no significant difference in JNK mRNA and protein expression among four groups (P> 0.05) .

Conclusion

DCA mayinhibit the invasion and migration of human renal cell carcinoma cell line A498 in a dose-dependent manner within a certain range, which is presumed to be related to the expressions of genes and proteins related to invasion and migration.

Key words: Dichloroacetic acid, Renal cancer, Invasion, Migration, Epithelial mesenchymal transformation

表1 引物序列信息

基因	序列（5'→3'）	预期扩增产物长度
JNK	上游ACTGCGTCTCATATTAGTCGTTG	284 bp
JNK	下游AGCTCTTATTAGACGCGTGATCT
E-cadherin	上游CTGATAGCTAGATTGATCTAGATC	296 bp
E-cadherin	下游TCGCTAGATTTGCTAGGGATCGATA
N-cadherin	上游CTGCTAGATAGCTAGATCGATATAGC	254 bp
N-cadherin	下游TCGAGATCGATTAGCTATTAGCGATA
β-actin （内参）	上游TCGATAGCTAGTAGCTATATGATC	286 bp
β-actin （内参）	下游CATGCTAGATCGATTAGATCGAGAT

表1 引物序列信息

基因	序列（5'→3'）	预期扩增产物长度
JNK	上游ACTGCGTCTCATATTAGTCGTTG	284 bp
JNK	下游AGCTCTTATTAGACGCGTGATCT
E-cadherin	上游CTGATAGCTAGATTGATCTAGATC	296 bp
E-cadherin	下游TCGCTAGATTTGCTAGGGATCGATA
N-cadherin	上游CTGCTAGATAGCTAGATCGATATAGC	254 bp
N-cadherin	下游TCGAGATCGATTAGCTATTAGCGATA
β-actin （内参）	上游TCGATAGCTAGTAGCTATATGATC	286 bp
β-actin （内参）	下游CATGCTAGATCGATTAGATCGAGAT

图1 倒置相差显微镜下观察不同组细胞侵袭活性（Giemsa染色，×100）

表2 不同组干预后细胞侵袭活性及迁移率比较（±s，n = 3）

分组	侵袭活性（个/视野）	迁移率（﹪）
阴性对照组	530.26±81.22	53.59±6.71
DCA低剂量组	372.74±50.06^a	36.26±5.01^a
DCA中剂量组	167.89±47.12^ab	23.95±4.20^ab
DCA高剂量组	75.33±10.09^abc	10.05±2.31^abc
F值	73.243	73.510
P值	< 0.001	< 0.001

表2 不同组干预后细胞侵袭活性及迁移率比较（±s，n = 3）

分组	侵袭活性（个/视野）	迁移率（﹪）
阴性对照组	530.26±81.22	53.59±6.71
DCA低剂量组	372.74±50.06^a	36.26±5.01^a
DCA中剂量组	167.89±47.12^ab	23.95±4.20^ab
DCA高剂量组	75.33±10.09^abc	10.05±2.31^abc
F值	73.243	73.510
P值	< 0.001	< 0.001

图2 倒置相差显微镜下观察不同组细胞迁移能力（×100）

表3 不同组JNK、E-cadherin、N-cadherin mRNA表达对比（±s，n = 3）

分组	JNK	E-cadherin	N-cadherin
阴性对照组	0.81±0.11	0.85±0.12	0.95±0.11
DCA低剂量组	0.83±0.12	1.02±0.11^a	0.80±0.10^a
DCA中剂量组	0.82±0.12	1.35±0.11^ab	0.58±0.07^ab
DCA高剂量组	0.81±0.10	1.52±0.12^abc	0.42±0.06^abc
F值	0.036	35.082	35.877
P值	0.990	< 0.001	< 0.001

表3 不同组JNK、E-cadherin、N-cadherin mRNA表达对比（±s，n = 3）

分组	JNK	E-cadherin	N-cadherin
阴性对照组	0.81±0.11	0.85±0.12	0.95±0.11
DCA低剂量组	0.83±0.12	1.02±0.11^a	0.80±0.10^a
DCA中剂量组	0.82±0.12	1.35±0.11^ab	0.58±0.07^ab
DCA高剂量组	0.81±0.10	1.52±0.12^abc	0.42±0.06^abc
F值	0.036	35.082	35.877
P值	0.990	< 0.001	< 0.001

图3 Western blot检测不同组JNK、E-cadherin、N-cadherin蛋白表达及p-JNK水平

表4 不同组JNK、E-cadherin、N-cadherin蛋白表达及p-JNK水平对比（±s，n = 3）

分组	JNK	E-cadherin	N-cadherin	P-JNK
阴性对照组	1.20±0.08	0.13±0.03	0.95±0.11	0.95±0.10
DCA低剂量组	1.22±0.09	0.37±0.08^a	0.74±0.07^a	0.68±0.07^a
DCA中剂量组	1.19±0.10	0.89±0.14^ab	0.25±0.04^ab	0.29±0.05^ab
DCA高剂量组	1.21±0.09	1.32±0.19^abc	0.15±0.03^abc	0.14±0.03^abc
F值	0.102	90.188	151.479	148.525
P值	0.958	< 0.001	< 0.001	< 0.001

表4 不同组JNK、E-cadherin、N-cadherin蛋白表达及p-JNK水平对比（±s，n = 3）

分组	JNK	E-cadherin	N-cadherin	P-JNK
阴性对照组	1.20±0.08	0.13±0.03	0.95±0.11	0.95±0.10
DCA低剂量组	1.22±0.09	0.37±0.08^a	0.74±0.07^a	0.68±0.07^a
DCA中剂量组	1.19±0.10	0.89±0.14^ab	0.25±0.04^ab	0.29±0.05^ab
DCA高剂量组	1.21±0.09	1.32±0.19^abc	0.15±0.03^abc	0.14±0.03^abc
F值	0.102	90.188	151.479	148.525
P值	0.958	< 0.001	< 0.001	< 0.001

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Inhibitory effect of dichloroacetic acid on invasion and migration of human renal cell carcinoma cell line A498

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