circ_0000267靶向miR-198对急性淋巴细胞白血病细胞KOCL44增殖和凋亡的影响

doi:10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2022.01.004

目的

探讨circ_0000267对急性淋巴细胞白血病（ALL）KOCL44细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制。

方法

选择ALL细胞株KOCL44为研究对象，分别将小干扰RNA （siRNA）阴性对照（si-NC）、circ_0000267 siRNA （si-circ_0000267）、微小RNA （miRNA）阴性对照（miR-NC）、miR-198模拟物（miR-198）、circ_0000267 siRNA+miRNA抑制剂阴性对照（si-circ_0000267+anti-miR-NC）和circ_0000267 siRNA+miR-198抑制剂（si-circ_0000267+anti-miR-198）转染细胞，48 h后通过RT-qPCR检测细胞circ_0000267和miR-198相对表达水平，采用CCK-8法检测KOCL44细胞的增殖水平，流式细胞术实验检测KOCL44细胞的凋亡水平，Western blot检测KOCL44细胞Ki-67、Bcl-2和Bax蛋白表达水平，通过双荧光素酶报告实验验证circ_0000267和miR-198靶向关系。两组间比较采用独立样本t检验。

结果

与健康志愿者比较，ALL患者circ_0000267表达水平（1.00±0.06比3.19±0.21）上调，miR-198表达水平（1.00±0.07比0.41±0.03）下调，差异有统计学意义（P < 0.05）。敲低circ_0000267或者过表达miR-198可抑制KOCL44细胞增殖（0.68±0.05比0.32±0.02、0.69±0.06比0.39±0.03）、Ki-67 （0.84±0.06比0.37±0.03、0.85±0.06比0.45±0.04）和Bcl-2蛋白表达（0.63±0.05比0.22±0.02、0.65±0.04比0.29±0.02），促进细胞凋亡[（6.53±0.51）﹪比（24.29±2.06）﹪、（7.38±0.57）﹪比（20.03±1.66）﹪]和Bax蛋白表达（0.31±0.03比0.77±0.04、0.30±0.02比0.71±0.04），差异有统计学意义（P < 0.05）。双荧光素酶报告实验验证circ_0000267可以靶向miR-198表达，干扰miR-198表达可以逆转抑制circ_0000267表达对KOCL44细胞的增殖和凋亡的作用，差异有统计学意义（P < 0.05）。

结论

circ_0000267通过调控miR-198抑制ALL细胞增殖，并促进凋亡，为临床治疗ALL提供新的依据。

关键词: 环状RNA, 微小RNA, 急性淋巴细胞白血病, 增殖, 凋亡

Objective

To study the role of circ_0000267 in the proliferation and apoptosis of acute lymphoblastic leukemia (ALL) and its mechanism.

Methods

siRNA Negative control (si-NC) , circ_0000267 siRNA (si-circ_0000267) , miRNA negative control (miR-NC) , miR-198 mimics (miR-198) , si-circ_0000267+anti-miR-NC and si-circ_0000267+anti-miR-198 were transfected into the acute lymphocytic leukemia cell line KOCL44. The cells were collected 48 h after transfection. The expressions of circ_0000267 and miR-198 were detected by RT-qPCR; CCK-8 method was used to detect the proliferation of KOCL44 cells; flow cytometry was used to detect the apoptosis of KOCL44 cells; Western blot was used to detect the protein expressions of Ki-67, Bcl-2 and Bax; and double luciferase reporting assay was used to verify the relationship between circ_0000267 and miR-198. The comparison between the two groups was analyzed by independent sample t test.

Results

Compared with healthy volunteers, the expression of circ_000026 (1.00±0.06 vs 3.19±0.21) was up-regulated in ALL patients, and the expression of miR-198 (1.00±0.07 vs 0.41±0.03) was down-regulated, and the difference was statistically significant (P < 0.05) . Knockdown of circ_0000267 or overexpression of miR-198 can significantly inhibit the proliferation of KOCL44 cells (0.68±0.05 vs 0.32±0.02, 0.69±0.06 vs 0.39±0.03) , the protein expression of Ki-67 (0.84±0.06 vs 0.37±0.03, 0.85±0.06 vs 0.45±0.04) and Bcl-2 (0.63±0.05 vs 0.22±0.02, 0.65±0.04 vs 0.29±0.02) , and increase the rate of apoptosis ([6.53±0.51]﹪vs [24.29±2.06]﹪, [7.38±0.57]﹪ vs [20.03±1.66]﹪) and the protein expression of Bax (0.31±0.03 vs 0.77±0.04, 0.30±0.02 vs 0.71±0.04) . All the differences were statistically significant (P < 0.05) . The dual luciferase report experiment verified that circ_0000267 can target miR-198, and interference with the expression of miR-198 reversed the effect of inhibiting the expression of circ_0000267 on the proliferation and apoptosis of KOCL44 cells, and the difference was also statistically significant (P < 0.05) .

Conclusions

circ_0000267 inhibits all cell proliferation and promotes apoptosis by regulating miR-198, providing a new basis for clinical treatment of all.

Key words: CircRNA, MicroRNA, Acute lymphoblastic leukemia, Proliferation, Apoptosis

表1 引物序列信息

基因	序列（5'→3'）	预期扩增产物长度（bp）
circ_0000267	上游ACGACAAGAAGGTCGGTGTT	124
	下游ATTCCCAGATGCTGGTGCTC
GAPDH	上游CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC	155
	下游ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC
miR-198	上游ATATGTCACTAGGTCCAGAGGGG	227
	下游TATGGTTGTTCTGCTCTCTGTGTC
miR-198逆转录	GCTGGATGTCGGATCTGTCAGCAGAGTGAGGACAACG
U6	上游CTCGCTTCGGCAGCACA	102
	下游AACGCTTCACGAATTTGCGT

表1 引物序列信息

基因	序列（5'→3'）	预期扩增产物长度（bp）
circ_0000267	上游ACGACAAGAAGGTCGGTGTT	124
	下游ATTCCCAGATGCTGGTGCTC
GAPDH	上游CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC	155
	下游ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC
miR-198	上游ATATGTCACTAGGTCCAGAGGGG	227
	下游TATGGTTGTTCTGCTCTCTGTGTC
miR-198逆转录	GCTGGATGTCGGATCTGTCAGCAGAGTGAGGACAACG
U6	上游CTCGCTTCGGCAGCACA	102
	下游AACGCTTCACGAATTTGCGT

图1 circ_0000267和miR-198在ALL患者中的相关性分析

表2 circ_0000267和miR-198在急性淋巴细胞白血病患者和健康志愿者单核细胞中的表达（ ± s）

分组	例数	circ_0000267	miR-198
健康志愿者	23	1.00±0.06	1.00±0.07
ALL患者	23	3.19±0.21	0.41±0.03
t值		48.089	37.154
P值		< 0.001	< 0.001

表2 circ_0000267和miR-198在急性淋巴细胞白血病患者和健康志愿者单核细胞中的表达（ ± s）

分组	例数	circ_0000267	miR-198
健康志愿者	23	1.00±0.06	1.00±0.07
ALL患者	23	3.19±0.21	0.41±0.03
t值		48.089	37.154
P值		< 0.001	< 0.001

图2 制circ_0000267表达对急性淋巴细胞白血病细胞KOCL44凋亡的影响注：a ~ b图分别为流式细胞术检测si-NC和si-circ_0000267的急性淋巴细胞白血病细胞KOCL44的凋亡率；c图为si-NC和si-circ_0000267细胞凋亡率比较；与si-NC组比较，^aP < 0.05

图3 抑制circ_0000267表达对急性淋巴细胞白血病细胞KOCL44增殖和凋亡相关蛋白表达的影响注：a图为Western blot检测Ki-67、Bcl-2和Bax的蛋白表达；b图为si-NC和si-circ_0000267的Ki-67、Bcl-2和Bax的蛋白相对表达量比较；与si-NC组比较，^aP < 0.05

表3 抑制circ_0000267表达对急性淋巴细胞白血病细胞KOCL44增殖的影响（ ± s）

分组	实验次数	circ_0000267	OD值（450 nm）
si-NC	3	1.00±0.06	0.68±0.05
si-circ_0000267	3	0.46±0.03	0.32±0.02
t值		24.150	20.055
P值		< 0.001	< 0.001

表3 抑制circ_0000267表达对急性淋巴细胞白血病细胞KOCL44增殖的影响（ ± s）

分组	实验次数	circ_0000267	OD值（450 nm）
si-NC	3	1.00±0.06	0.68±0.05
si-circ_0000267	3	0.46±0.03	0.32±0.02
t值		24.150	20.055
P值		< 0.001	< 0.001

图4 circ_0000267的序列中含有与miR-198互补的核苷酸序列

表4 双荧光素酶报告实验（ ± s）

分组	实验次数	WT-cic_0000267 MUT-circ_0000267
miR-NC	3	1.02±0.08	1.01±0.07
miR-198	3	0.52±0.03	1.04±0.07
t值		17.556	0.909
P值		< 0.001	0.377

表4 双荧光素酶报告实验（ ± s）

分组	实验次数	WT-cic_0000267 MUT-circ_0000267
miR-NC	3	1.02±0.08	1.01±0.07
miR-198	3	0.52±0.03	1.04±0.07
t值		17.556	0.909
P值		< 0.001	0.377

图5 miR-198过表达对急性淋巴细胞白血病细胞KOCL44增殖和凋亡的影响注：a ~ b图分别为流式细胞术检测转染miR-NC和miR-198的KOCL44细胞凋亡率；c图为Western blot检测Ki-67、Bcl-2和Bax的蛋白表达

图6 miR-198过表达对急性淋巴细胞白血病细胞KOCL44增殖和凋亡的影响注：a ~ b图分别为流式细胞术检测转染si-circ_0000267+anti-miR-NC和si-circ_0000267+anti-miR-198的KOCL44细胞凋亡率；c图为Western blot检测Ki-67、Bcl-2和Bax的蛋白表达

表5 miR-198过表达对急性淋巴细胞白血病细胞KOCL44增殖和凋亡的影响（ ± s）

分组	实验次数	miR-198	OD值（450 nm）	凋亡率（﹪）	Ki-67蛋白	Bcl-2蛋白	Bax蛋白
miR-NC	3	1.00±0.04	0.69±0.06	6.53±0.51	0.84±0.06	0.63±0.05	0.31±0.03
miR-198	3	3.32±0.27	0.39±0.03	24.29±2.06	0.37±0.03	0.22±0.02	0.77±0.04
t值		25.499	13.416	25.106	21.019	22.841	27.600
P值		< 0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001

表5 miR-198过表达对急性淋巴细胞白血病细胞KOCL44增殖和凋亡的影响（ ± s）

分组	实验次数	miR-198	OD值（450 nm）	凋亡率（﹪）	Ki-67蛋白	Bcl-2蛋白	Bax蛋白
miR-NC	3	1.00±0.04	0.69±0.06	6.53±0.51	0.84±0.06	0.63±0.05	0.31±0.03
miR-198	3	3.32±0.27	0.39±0.03	24.29±2.06	0.37±0.03	0.22±0.02	0.77±0.04
t值		25.499	13.416	25.106	21.019	22.841	27.600
P值		< 0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001

表6 干扰miR-198表达可以逆转抑制circ_0000267表达对急性淋巴细胞白血病细胞KOCL44增殖和凋亡的作用（ ± s）

分组	实验次数	miR-198	OD值（450 nm）	凋亡率（﹪）	Ki-67蛋白	Bcl-2蛋白	Bax蛋白
si-circ_0000267+anti-miR-NC	3	1.00±0.06	0.31±0.03	25.87±2.11	0.35±0.03	0.21±0.02	0.79±0.04
si-circ_0000267+anti-miR-198	3	0.29±0.03	0.57±0.04	11.83±1.22	0.73±0.05	0.54±0.03	0.42±0.03
t值		31.752	15.600	17.281	19.551	27.458	22.200
P值		< 0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001

表6 干扰miR-198表达可以逆转抑制circ_0000267表达对急性淋巴细胞白血病细胞KOCL44增殖和凋亡的作用（ ± s）

分组	实验次数	miR-198	OD值（450 nm）	凋亡率（﹪）	Ki-67蛋白	Bcl-2蛋白	Bax蛋白
si-circ_0000267+anti-miR-NC	3	1.00±0.06	0.31±0.03	25.87±2.11	0.35±0.03	0.21±0.02	0.79±0.04
si-circ_0000267+anti-miR-198	3	0.29±0.03	0.57±0.04	11.83±1.22	0.73±0.05	0.54±0.03	0.42±0.03
t值		31.752	15.600	17.281	19.551	27.458	22.200
P值		< 0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001

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Role of circ_0000267 targeting miR-198 in the proliferation and apoptosis of acute lymphoblastic leukemia cells KOCL44

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