人脐带间充质干细胞来源外泌体抑制肝星状细胞活化发挥抗肝纤维化作用的实验研究

doi:10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2025.03.003

目的

探讨人脐带间充质干细胞外泌体（hucMSC-Exo）在体内、外抑制肝星状细胞（HSCs）活化及改善肝纤维化的效应。

方法

外泌体提取和纯化采用高速离心法，用透射电镜、纳米颗粒跟踪分析仪、Western blot 法对外泌体进行表征。在体实验选用雄性C57BL/6J小鼠为实验对象，分为4 组：正常对照组、模型组、hucMSC-Exo 干预组和秋水仙碱干预组，每组10 只。肝纤维化小鼠模型制备采用CCl₄-橄榄油（1 ： 3）混合液灌胃法，2 次/周，共8 周。治疗组于4 周末在造模基础上实施外泌体尾静脉注射（300 μg/100 g 体质量）和秋水仙碱灌胃（0.01 mg/100 g 体质量）干预。8 周末取材，生化分析法检测血清中丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST），酶联免疫法检测Ⅳ型胶原（Collagen-Ⅳ）、层粘连蛋白（LN）、Ⅲ型前胶原（PC-Ⅲ）及透明质酸（HAase）水平，HE 和Masson 法检测肝组织病理变化，免疫组化法检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和I 型胶原（Collagen-Ⅰ）表达。离体实验选用人肝星形细胞系LX-2 细胞为实验对象，分3 组：空白对照组、转化生长因子-β₁ （TGF-β₁）诱导组和TGF-β₁ 诱导+ hucMSC-Exo 干预组，采用免疫荧光法检测各组细胞α-SMA 的表达，Western blot检测各组细胞内α-SMA 和Collagen-Ⅰ蛋白水平。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验。

结果

小鼠血清生化分析结果表明，与正常对照组比较，模型组ALT、AST、Collagen-Ⅳ、LN 和HAase 水平均升高（P 均＜ 0.01）。与模型组比较，hucMSC-Exo 干预组ALT[（3.17 ± 0.70）比（6.34 ± 0.37） U/L］，AST [（2.91 ± 0.60）比（7.11 ± 0.41）U/L］，Collagen-Ⅳ [（116.38 ± 4.96）比（143.79 ± 6.71） μg/L］，LN [（762.96 ± 120.45）比（950.86 ±29.77） μg/L］，PC-Ⅲ[（14.88 ± 0.83）比（18.39 ± 2.57） μg/L］，HAase [（109.92 ± 11.32）比（187.58 ± 10.42） ng/L］均降低，差异具有统计学意义（P 均＜ 0.01）。肝组织免疫组化结果显示：与正常对照组比较，模型组α-SMA 和Collagen-Ⅰ表达水平均增高（P 均＜ 0.01）。与模型组比较，hucMSC-Exo 干预组肝组织中α-SMA （337.05 ± 39.13 比2 681.83 ± 312.63）及Collagen-Ⅰ（479.32 ± 86.25 比1 022.57 ± 102.13）表达水平均降低，差异有统计学意义（P 均＜ 0.01）；LX-2细胞裂解液Western blot 检测结果提示：与模型组比较，hucMSC-Exo 干预组α-SMA 蛋白（0.87 ±0.09 比1.01 ± 0.34）及Collagen-Ⅰ （0.46 ± 0.07 比0.75 ± 0.22）蛋白表达均下降，差异具有统计学意义（P 均＜ 0.05）。

结论

早期移植hucMSC-Exo 能抑制CCl₄ 诱导小鼠肝纤维化病理进程，其初步作用机制与hucMSC-Exo 抑制肝星状细胞的活化和胶原蛋白的合成、分泌相关。

关键词: 脐带间充质干细胞, 外泌体, 肝星状细胞, 肝纤维化

Objective

To evaluate the therapeutic effects of human umbilical cord mesenchymal stem cell-derived exosomes （hucMSC-Exo） in inhibiting the activation of hepatic stellate cells （HSCs） and improving liver fibrosis in vivo and in vitro.

Methods

The exosomes were isolated and purified by ultracentrifugation and characterized by transmission electron microscopy（TEM）， nanoparticle size analysis， and Western blot. For in vivo experiments， 40 male C57BL/6J mice were divided into 4 groups： normal control group， model group， exosome treatment group，and colchicine treatment group （n = 10）. The hepatic fibrosis model was built by intragastric administration of CCl₄-olive oil （1 ： 3）， 2 times/week for 8 weeks. After 4 weeks of modeling，intervention treatments were carried out： exosomes were proceeded by intravenous injection administration （300μg/100g body weight）， and colchicine was given by intragastric administration（0.01mg/100g body weight）. At the end of 8 weeks， levels of ALT， AST， IV-C， LN， PC-III， and HAase in serum were measured using biochemical assays and ELISA methods. Liver histopathological changes were assessed with H&E and Masson staining， and α-smooth muscle actin （α-SMA） and Collagen-Ⅰ expression in liver tissue were detected using immunohistochemistry. For in vitro experiments， the human HSC cell line LX-2 was treated with TGF-β₁ and hucMSC- Exo， and named blank control， TGF-β₁ induction group， TGF-β₁ induction+hucMSC-Exo group. Immunofluorescence was used to analyze the expression of α-SMA， and Western blot was performed to detect the expression levels of α-SMA and Collagen-Ⅰ proteins. One-way analysis of variance was used for comparison between multiple groups， and LSD-t test was used for pairwise comparison between groups.

Results

Compared to the normal control group， the levels of ALT， AST， Collagen-Ⅳ， LN，PC-Ⅲ， and HAase were increased （all P ＜ 0.01）. Compared to the model group， the levels of ALT[（3.17 ± 0.70） vs （ 6.34 ± 0.37） U/ L］， AST [（2.91 ± 0.60） vs （7.11 ± 0.41）U/ L］， Collagen-Ⅳ[（116.38 ± 4.96）vs （143.79 ± 6.71） μg/ L］， LN [（762.96 ± 120.45） vs （950.86 ± 29.77） μg/ L］，PC- Ⅲ[（14.88 ± 0.83）vs （18.39 ± 2.57） μg/ L］and HAase [（109.92 ± 11.32）vs （187.58 ±10.42） ng/L］ were decreased significantly in the hucMSC-Exo treatment group （all P ＜ 0.01）.Immunohistochemical results of liver tissues showed that the level of the expression of α-SMA and Collagen-Ⅰ was increased （all P ＜ 0.01）. Compared to the model group， the expression of α-SMA（ 337.05 ± 39.13 vs 2 681.83 ± 312.63）， and Collagen-Ⅰ expression （479.32 ± 86.25 vs 1 022.57 ±102.13）were decreased in liver tissues in hucMSC-Exo intervention group （all P ＜ 0.01）. The Western blot data of LX-2 cell lysate indicated that hucMSC- Exo inhibited the expression of α-SMA and Collagen-Ⅰ in LX-2 cells compared to the model group [（0.87 ± 0.09 vs 1.01 ± 0.34） and（0.46 ± 0.07 vs 0.75 ± 0.22）］（all P ＜ 0.05）.

Conclusion

Early stage transplantation of hucMSCExo ameliorates hepatic fibrosis induced by CCl₄ in rats， which may be induced by suppressing HSCs activation and the synthesis and secretion of collagen.

Key words: Human umbilical cord mesenchymal stem, Exosomes, Hepatic stellate cell, Hepatic fibrosis

图1 hucMSC-Exo 干预CCl₄ 诱导的肝纤维化实验流程

图2 脐带间充质干细胞表征结果注：a 图为倒置显微镜观察体外培养活体状态人脐带间充质干细胞形态特征，标尺为150 μm；b ～ g 图为流式细胞术检测CD73、CD90、CD105 及CD34、CD45、HLA- DR 的表达水平

图3 人脐带间充质干细胞来源外泌体表征结果注：a 图为透射电镜观察人脐带间充质干细胞来源外泌体（杯托样结构）代表性照片，标尺400 nm；b 图为粒径检测（平均142 nm）代表性结果；c 图为Western blot 检测膜标志蛋白CD9 和CD81 蛋白表达（1、2、3 为三个批次纯化样品）

表1 小鼠血清生化检测结果（± s，n = 6）

分组	ALT（ U/L）	AST（ U/L）	Collagen-Ⅳ（ μg/L）	PC- Ⅲ（ μg/L）	HAase（ ng/L）	LN（ μg/L）
正常对照组	1.97 ± 0.46	1.80 ± 0.62	101.41 ± 9.97	13.89 ± 0.62	102.51 ± 4.37	728.01 ± 141.24
模型组	6.34 ± 0.37^a	7.11 ± 0.41^a	143.79 ± 6.71^a	18.39 ± 2.57^a	187.58 ± 10.42^a	950.86 ± 29.77^a
hucMSC-Exo 干预组	3.17 ± 0.70^b	2.91 ± 0.60^b	116.38 ± 4.96^b	14.88 ± 0.83^b	109.92 ± 11.32^b	762.96 ± 120.45^b
秋水仙碱干预组	2.99 ± 0.81^b	2.19 ± 0.60^b	123.00 ± 2.51^b	16.28 ± 0.92	166.61 ± 7.91	764.84 ± 95.24
F值	57.081	112.102	42.370	10.721	132.480	5.501
P值	＜ 0.001	＜ 0.001	＜ 0.001	＜ 0.001	＜ 0.001	0.010

表1 小鼠血清生化检测结果（± s，n = 6）

分组	ALT（ U/L）	AST（ U/L）	Collagen-Ⅳ（ μg/L）	PC- Ⅲ（ μg/L）	HAase（ ng/L）	LN（ μg/L）
正常对照组	1.97 ± 0.46	1.80 ± 0.62	101.41 ± 9.97	13.89 ± 0.62	102.51 ± 4.37	728.01 ± 141.24
模型组	6.34 ± 0.37^a	7.11 ± 0.41^a	143.79 ± 6.71^a	18.39 ± 2.57^a	187.58 ± 10.42^a	950.86 ± 29.77^a
hucMSC-Exo 干预组	3.17 ± 0.70^b	2.91 ± 0.60^b	116.38 ± 4.96^b	14.88 ± 0.83^b	109.92 ± 11.32^b	762.96 ± 120.45^b
秋水仙碱干预组	2.99 ± 0.81^b	2.19 ± 0.60^b	123.00 ± 2.51^b	16.28 ± 0.92	166.61 ± 7.91	764.84 ± 95.24
F值	57.081	112.102	42.370	10.721	132.480	5.501
P值	＜ 0.001	＜ 0.001	＜ 0.001	＜ 0.001	＜ 0.001	0.010

图4 Masson 染色图像分析结果（×200）注：^*P ＜ 0.05，^**P ＜ 0.01；n = 7

图5 光学显微镜下观察小鼠肝组织病理变化（×200）注：a ～ d 图为肝组织石蜡切片HE 染色，标尺为100 μm；e ～ h 图为肝组织石蜡切片Masson 染色，标尺为100 μm

图6 光学显微镜下观察小鼠肝组织石蜡切片α-SMA 免疫组化、DAB 显色结果（×200）。^**P ＜ 0.01，n = 6，标尺为100 μm

图7 光学显微镜下观察小鼠肝组织石蜡切片Collagen-Ⅰ免疫组化、DAB 显色结果（×200）。^**P ＜ 0.01，n = 6，标尺为100 μm

图8 荧光显微镜下观察LX-2 细胞α-SMA 表达（×200）注：标尺为5 μm

图9 hucMSC-Exo 体外抑制LX-2 细胞活化的检测结果注：^**P ＜ 0.01，n = 3

1	Marcellin P， Kutala BK. Liver diseases： A major， neglected global public health problem requiring urgent actions and large-scale screening［J］. Liver Int， 2018， 38 Suppl 1：2-6.
2	Altamirano-Barrera A， Barranco-Fragoso B， Méndez-Sánchez N.Management strategies for liver fibrosis［J］. Ann Hepatol， 2017，16（1）：48-56.
3	Akkız H， Gieseler RK， Canbay A. Liver fibrosis： from basic science towards clinical progress， focusing on the central role of hepatic stellate cells［J］. Int J Mol Sci. 2024， 25（14）：7873. doi： 10.3390/ijms25147873.
4	Hou J， Wong VW， Qian Y， et al. Detecting early-stage liver fibrosis using macromolecular proton fraction mapping based on Spin-Lock MRI： preliminary observations［J］. J Magn Reson Imaging， 2023，57（2）：485-492.
5	Chen L， Brenner DA， Kisseleva T. Combatting fibrosis：exosomebased therapies in the regression of liver fibrosis［J］. Hepatol Commun，2018， 3（2）：180-192.
6	Yuan M， Yao L， Chen P， et al. Human umbilical cord mesenchymal stem cells inhibit liver fibrosis via the microRNA-148a-5p/SLIT3 axis［J］. Int Immunopharmacol， 2023， 125（Pt A）：111134. doi： 10.1016/j.intimp.2023.111134.
7	Mathieu M， Martin-Jaular L， Lavieu G， et al. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication［J］. Nat Cell Biol， 2019， 21（1）：9-17
8	邓瑞锋，程璐，周宇林，等. TGF-β₁ 诱导骨髓间充质干细胞外泌体分泌miR-424-3p 促进前列腺癌细胞增殖及转移［J］. 中华腔镜泌尿外科杂志（电子版）， 2024， 18（1）：82-89.
9	周晓磊，徐岩，金煜，等. 间充质干细胞外泌体抗肝纤维化的机制及其优化策略［J］. 中国生物工程杂志， 2024， 44（6）： 41-52.
10	Zong R， Zheng Y， Yan Y， et al. Mesenchymal stem cells-derived exosomes alleviate liver fibrosis by targeting Hedgehog/SMO signaling［J］. Hepatology International， 2024， 18（6）：1781-1791.
11	Zhu D， Sun Z， Wei J， et al. BMP7-loaded human umbilical cord mesenchymal stem cell-derived small extracellular vesicles ameliorate liver fibrosis by targeting activated hepatic stellate cells［J］. Int J Nanomedicine， 2024， 19：3475-3495.
12	Hermansyah D， Putra A， Muhar AM， et al. Mesenchymal stem cells suppress TGF-β release to decrease α-SMA expression in ameliorating CCl₄-induced liver fibrosis［J］. Med Arch， 2021， 75（1）：16-22.
13	Du QH， Zhang CJ， Li WH， et al. Gan Shen Fu Fang ameliorates liver fibrosis in vitro and in vivo by inhibiting the inflammatory response and extracellular signal-regulated kinase phosphorylation［J］. World J Gastroenterol， 2020， 26（21）：2810-2820.
14	Yang X， Li Q， Liu W， et al. Mesenchymal stromal cells in hepatic fibrosis/cirrhosis： from pathogenesis to treatment［J］， Cell Mol Immunol， 2023， 20（6）：583-599.
15	孙慧聪，张国尊，郭金波，等. 脐带源间充质干细胞移植治疗肝纤维化及肝硬化的相关机制［J］.中国组织工程研究， 2015，19（41）：6638-6645.
16	Qin L， Liu N， Bao CL Mesenchymal stem cells in fibrotic diseases-the two sides of the same coin［J］. Acta Pharmacol Sin， 2023， 44（2）：268-287.
17	冯啸，陈良，张琪，等. 人脐带间充质干细胞来源的外泌体减轻肝脏缺血再灌注损伤及机制的初步研究［J/CD］. 中华细胞与干细胞杂志（电子版）， 2017， 7（4）：224-231.
18	Zhang Z， Shang J， Yang Q， et al. Exosomes derived from human adipose mesenchymal stem cells ameliorate hepatic fibrosis by inhibiting PI3K/Akt/mTOR pathway and remodeling choline metabolism［J］. J Nanobiotechnology， 2023， 21（1）：29. doi：10.1186/s12951-023-01788-4.
19	Jiang W， Tan Y， Cai M， et al. Human umbilical cord MSC-derived exosomes suppress the development of CCl₄-induced liver injury through antioxidant effect［J］. Stem Cells Int， 2018， 2018：6079642. doi：10.1155/2018/6079642
20	Qu Y， Zhang Q， Cai X， et al. Exosomes derived from miR-181-5pmodified adipose-derived mesenchymal stem cells prevent liver fibrosis via autophagy activation［J］. J Cell Mol Med， 2017， 21（10）：2491-2502.
21	Hermansyah D， Putra A， Muhar AM， et al. Mesenchymal stem cells suppress TGF-β release to decrease α-SMA expression in ameliorating CCl₄-induced liver fibrosis［J］. Med Arch， 2021，75（1）：16-22.
22	Xu Y， Zhou X， Wang X， et al. Progress of mesenchymal stem cells（MSCs） & MSC-Exosomes combined with drugs intervention in liver fibrosis［J］. Biomed Pharmacother， 2024， 176：116848. doi： 10.1016/j.biopha.2024.116848.
23	Huang B， Cheng X， Wang H， et al. Mesenchymal stem cells and their secreted molecules predominantly ameliorate fulminant hepatic failure and chronic liver fibrosis in mice respectively［J］. J Transl Med，2016，14：45. doi： 10.1186/s12967-016-0792-1.

[1]	刘政宏, 袁春銮. 乳腺癌患者血清外泌体中长链非编码RNA BC200的表达及临床意义[J/OL]. 中华乳腺病杂志(电子版), 2024, 18(04): 212-216.
[2]	黄晓芳, 刘澍雨, 黄子荣, 胡艳, 梁家敏, 朱伟民. 软骨细胞来源外泌体对于软骨损伤修复的研究进展[J/OL]. 中华关节外科杂志(电子版), 2024, 18(06): 751-758.
[3]	张晓波, 巴特, 黄瑞娟, 王宏宇. 间充质干细胞外泌体改善急性肺损伤机制的研究进展[J/OL]. 中华损伤与修复杂志(电子版), 2025, 20(01): 81-85.
[4]	曾繁润, 林永勇, 王君. 间充质干细胞外泌体促进创面血管新生机制的研究进展[J/OL]. 中华损伤与修复杂志(电子版), 2025, 20(01): 86-89.
[5]	刘昌玲, 张金丽, 张志, 李孝建, 汤文彬, 胡逸萍, 陈宾, 谢晓娜. 负载人脂肪干细胞外泌体的甲基丙烯酰化明胶水凝胶对人皮肤成纤维细胞增殖和迁移的影响[J/OL]. 中华损伤与修复杂志(电子版), 2024, 19(06): 517-525.
[6]	宋勤琴, 李双汝, 李林, 杜鹃, 刘继松. 间充质干细胞源性外泌体在改善病理性瘢痕中作用的研究进展[J/OL]. 中华损伤与修复杂志(电子版), 2024, 19(06): 550-553.
[7]	刘咏博, 郭佳. 外泌体在前列腺癌细胞免疫逃逸中的研究进展[J/OL]. 中华腔镜泌尿外科杂志(电子版), 2025, 19(02): 140-145.
[8]	杨健, 杨璐. 体液外泌体在前列腺癌诊断中的应用前景[J/OL]. 中华腔镜泌尿外科杂志(电子版), 2025, 19(02): 146-151.
[9]	徐康乔, 张国清, 严智亮, 姜涌斌. 外泌体环状RNA 与肺癌关系[J/OL]. 中华肺部疾病杂志(电子版), 2025, 18(02): 334-337.
[10]	蔡定钦, 孙建国, 陈旭. 外泌体非编码RNAs与肺癌放射治疗的研究进展[J/OL]. 中华肺部疾病杂志(电子版), 2024, 17(04): 655-658.
[11]	张剑豪, 蔡丹文, 蒋辰浩, 张宇君, 韩路, 赵雪刚, 吕行, 萧家麒, 张杰滨, 隋昕, 张英才. 过表达POSTN 的间充质干细胞来源外泌体增强肝脏再生能力[J/OL]. 中华细胞与干细胞杂志(电子版), 2025, 15(02): 65-74.
[12]	梁瑶瑶, 邬绿莹, 陈津. 负载干细胞外泌体水凝胶治疗糖尿病足溃疡的研究进展[J/OL]. 中华细胞与干细胞杂志(电子版), 2025, 15(02): 112-119.
[13]	袁雨涵, 杨盛力. 体液和组织蛋白质组学分析在肝癌早期分子诊断中的研究进展[J/OL]. 中华肝脏外科手术学电子杂志, 2024, 13(06): 883-888.
[14]	季鹏程, 鄂一民, 陆晨, 喻春钊. 循环外泌体相关生物标志物在结直肠癌诊断中的研究进展[J/OL]. 中华结直肠疾病电子杂志, 2024, 13(04): 265-273.
[15]	李浩, 陈棋帅, 费发珠, 张宁伟, 李元东, 王硕晨, 任宾. 慢性肝病肝纤维化无创诊断的研究进展[J/OL]. 中华临床医师杂志(电子版), 2024, 18(09): 863-867.

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The anti-hepatic fibrosis effects of human umbilical cord mesenchymal stem cell-derived exosomes by inhibiting hepatic stellate cells activation

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