巨噬细胞迁移抑制因子靶向miR-127-3p对人肾癌细胞生物学行为的影响

doi:10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2023.02.002

目的

探讨miR-127-3p对巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）的调控作用及对人肾癌细胞GRC-1生物学行为的影响。

方法

人肾癌GRC-1细胞分别转染mir-127-3p minic，MIF过表达质粒和共转染miR-127-3P minic和MIF过表达质粒，未做任何处理的细胞为对照。实时定量PCR检测临床肾癌组织以及癌旁正常组织中miR-127-3p及MIF mRNA的表达情况，Pearson相关分析癌组织中miR-127-3p及MIF mRNA表达水平相关性。荧光素酶报告系统确定miR-127-3p对MIF的调控作用。分析miR-127-3p对细胞增殖能力、凋亡情况、侵袭能力以及迁移能力的影响，并检测MIF蛋白表达情况。组间比较采用配对t检验，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。

结果

与癌旁组织比较，肾癌组织中miR-127-3p的表达量（1.16 ± 0.25比1.65 ± 0.38）降低，肾癌组织中MIF mRNA的表达量（1.32 ± 0.18比0.32 ± 0.11）升高（P < 0.05）。肾癌组织中miR-127-3p与MIF mRNA表达水平呈负相关性（r = - 0.612，P < 0.05）。荧光素酶实验表明miR-127-3p可靶向MIF。与对照比较，MIF过表达2 ~ 4 d的细胞增殖倍数升高，而miR-127-3p mimic细胞增殖倍数降低（P < 0.05）。与对照比较，miR-127-3p mimic、共转染肾癌GRC-1细胞凋亡率升高，而MIF过表达细胞凋亡率降低（P < 0.05）。与对照比较，miR-127-3p mimic肾癌GRC-1细胞侵袭数、MIF蛋白表达降低，而MIF过表达、共转染细胞侵袭数增加（P < 0.05）。与对照比较，miR-127-3p mimic、共转染肾癌GRC-1细胞划痕愈合率降低，而MIF过表达细胞划痕愈合率升高（P < 0.05）。

结论

肾癌组织中miR-127-3p处于低表达状态，肾癌GRC-1细胞过表达miR-127-3p通过下调MIF表达，从而抑制肾癌GRC-1细胞的增殖、迁移和侵袭，诱导细胞凋亡。

关键词: miR-127-3p, 巨噬细胞迁移抑制因子, 肾癌细胞, 生物学行为, 分子机制

Objective

To study the regulation of miR-127-3p on macrophage migration inhibitory factor (MIF) and its effect on the biological behavior of human renal cell carcinoma cell line GRC-1.

Methods

Human GRC-1 cells were transfected with miR-127-3p minic, MIF-overexpressed plasmid and cotransfected with miR-127-3p minic and MIF-overexpressed plasmid. The untreated cells were set as control. Real-time quantitative PCR was used to detect the expression of miR-127-3p and MIF mRNA in clinical renal cancer tissues and adjacent normal tissues, and the correlation between miR-127-3p and MIF mRNA expression levels in cancer tissues was analyzed by Pearson correlation. The luciferase reporter system determines the regulatory effect of miR-127-3p on MIF. The effects of miR-127-3p on cell proliferation, apoptosis, invasion and migration were analyzed, and the expression of MIF protein was detected. The measurement data between the two groups were compared by paired t-test, and the comparison between multiple groups was conducted by one-way ANOVA.

Results

Compared with adjacent tissues, the expression of miR-127-3p was decreased in renal cancer tissue (1.16 ± 0.25 vs 1.65 ± 0.38), while the expression of MIF mRNA was significantly increased (1.32 ± 0.18 vs 0.32 ± 0.11, P < 0.05). The expression levels of miR-127-3p and MIF mRNA in renal cancer tissues were negatively correlated (r = - 0.612, P < 0.05). Luciferase experiments showed that miR-127-3p targeted MIF. Compared with the control, the MIF overexpression increased cell proliferation after transfection 2 ~ 4 days, while the miR-127-3p mimic decreased cell proliferation (P < 0.05). Compared with the control, the apoptosis rate was increased in the miR-127-3p mimic-transfected cells and co-transfected GRC-1 cells. In contrast, the apoptosis rate was decreased in the MIF-overexpressed cells. Compared with the control, the miR-127-3p mimic decreased the invasion number and MIF protein expression in renal cancer GRC-1 cells, while MIF overexpression, and co-transfection increased the cell invasion number (P < 0.05). Compared with the control, the scratch healing rate was decreased in the miR-127-3p mimic -transfected cells and co-transfected cells. While the scratch healing rate was increased in the MIF-overexpressed cells (P < 0.05) .

Conclusion

miR-127-3p is underexpressed in renal cancer tissues, and miR-127-3p overexpression inhibits the proliferation, migration and invasion and induces apoptosis of renal cancer GRC-1 cells by down-regulating the expression of MIF.

Key words: miR-127-3p, Macrophage migration inhibitory factor, Renal cancer cell, Biological behavior, Molecular mechanism

表1 引物序列信息

基因	引物序列（5'→3'）	预期扩增产物长度（bp）
miR-127-3p	上游TCCGTCTGAGCTTGGCTAAA	212
	下游TCGGATCCGTCTGAGCTTGGCT
MIF	上游AGAACCGCTCCTACAGCAAG	234
	下游ATTTCTCCCCACCAGAAGGT
U6	上游CTCGCTTCGGCAGCACA	125
	下游AACGCTTCACGAATTTGCGT
GAPDH	上游TGAACGGGAAGCTCACTGG	307
	下游TCCACCACCCTGTTGCTGGA

表1 引物序列信息

基因	引物序列（5'→3'）	预期扩增产物长度（bp）
miR-127-3p	上游TCCGTCTGAGCTTGGCTAAA	212
	下游TCGGATCCGTCTGAGCTTGGCT
MIF	上游AGAACCGCTCCTACAGCAAG	234
	下游ATTTCTCCCCACCAGAAGGT
U6	上游CTCGCTTCGGCAGCACA	125
	下游AACGCTTCACGAATTTGCGT
GAPDH	上游TGAACGGGAAGCTCACTGG	307
	下游TCCACCACCCTGTTGCTGGA

图1 癌组织miR-127-3p与MIF mRNA表达水平相关性

图2 Western blot测定MIF蛋白表达水平

图3 MIF野生型序列中与miR-127-3p互补的序列

表2 miR-127-3p对MIF荧光素酶活性的影响（ ± s）

分组	实验次数	MIF野生型	MIF突变型
miR-127-3p-NC	5	3.28 ± 0.45	3.16 ± 0.42
miR-127-3p	5	1.92 ± 0.34	3.02 ± 0.41
t值		5.392	0.533
P值		0.001	0.608

表2 miR-127-3p对MIF荧光素酶活性的影响（ ± s）

分组	实验次数	MIF野生型	MIF突变型
miR-127-3p-NC	5	3.28 ± 0.45	3.16 ± 0.42
miR-127-3p	5	1.92 ± 0.34	3.02 ± 0.41
t值		5.392	0.533
P值		0.001	0.608

图4 人肾癌GRC-1细胞增殖情况

表3 人肾癌GRC-1细胞增殖情况

分组	实验次数	1 d	2 d	3 d	4 d
对照	5	1.28 ± 0.06	2.57 ± 0.08	3.97 ± 0.11	4.35 ± 0.09
miR-127-3p mimic	5	1.14 ± 0.09	2.01 ± 0.18^a	2.23 ± 0.21^a	2.55 ± 0.29^a
MIF过表达	5	1.56 ± 0.08	3.68 ± 0.15^ab	4.53 ± 0.29^ab	5.68 ± 0.32^ab
共转染	5	1.28 ± 0.08	2.44 ± 0.26^abc	3.85 ± 0.17^abc	4.58 ± 0.16^abc
F值		0.785	5.685	9.147	16.254
P值		0.164	< 0.001	< 0.001	< 0.001

表3 人肾癌GRC-1细胞增殖情况

分组	实验次数	1 d	2 d	3 d	4 d
对照	5	1.28 ± 0.06	2.57 ± 0.08	3.97 ± 0.11	4.35 ± 0.09
miR-127-3p mimic	5	1.14 ± 0.09	2.01 ± 0.18^a	2.23 ± 0.21^a	2.55 ± 0.29^a
MIF过表达	5	1.56 ± 0.08	3.68 ± 0.15^ab	4.53 ± 0.29^ab	5.68 ± 0.32^ab
共转染	5	1.28 ± 0.08	2.44 ± 0.26^abc	3.85 ± 0.17^abc	4.58 ± 0.16^abc
F值		0.785	5.685	9.147	16.254
P值		0.164	< 0.001	< 0.001	< 0.001

图5 人肾癌GRC-1细胞凋亡情况注：与对照比较，^aP < 0.05；与miR-127-3p mimic比较，^bP < 0.05；与MIF过表达比较，^cP < 0.05

图6 流式细胞术检测人肾癌GRC-1细胞凋亡情况

图7 人肾癌GRC-1细胞侵袭情况注：与对照比较，^aP < 0.05；与miR-127-3p mimic比较，^bP < 0.05；与MIF过表达比较，^cP < 0.05

图8 Transwell检测GRC-1细胞侵袭情况（台盼蓝染色，×200）

图9 人肾癌GRC-1细胞迁移情况

图10 人肾癌GRC-1细胞凋亡情况注：与对照比较，^aP < 0.05；与miR-127-3p mimic比较，^bP < 0.05；与MIF过表达比较，^cP < 0.05

图11 肾癌GRC-1细胞MIF蛋白表达情况注：a图为MIF蛋白表达情况，与对照比较，^aP < 0.05；与miR-127-3p mimic比较，^bP < 0.05；与MIF过表达比较，^cP < 0.05；b图为Western blot检测MIF蛋白表达水平

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