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中华细胞与干细胞杂志(电子版)

中华细胞与干细胞杂志(电子版) ›› 2021, Vol. 11 ›› Issue (04) : 215 -221. doi: 10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2021.04.004

论著

miR-942-5p靶向TRAF6对病毒性心肌炎细胞损伤的影响
杨婷1,†()   
  1. 1. 044000　运城，山西省运城市中心医院心内科
  • 收稿日期:2021-03-22 出版日期:2021-08-01
  • 通信作者: 杨婷

The effect of miR-942-5p on viral myocarditis cell injury by targeting TRAF6

Ting Yang1,†()   

  1. 1. Internal Medicine-Cardiovascular Department, Shanxi Yuncheng Central Hospital, Yuncheng 044000, China
  • Received:2021-03-22 Published:2021-08-01
  • Corresponding author: Ting Yang
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引用本文：

杨婷. miR-942-5p靶向TRAF6对病毒性心肌炎细胞损伤的影响[J]. 中华细胞与干细胞杂志(电子版), 2021, 11(04): 215-221.

Ting Yang. The effect of miR-942-5p on viral myocarditis cell injury by targeting TRAF6[J]. Chinese Journal of Cell and Stem Cell(Electronic Edition), 2021, 11(04): 215-221.

目的

探讨miR-942-5p靶向肿瘤坏死因子受体相关因子6 （TRAF6）对病毒性心肌炎细胞损伤的影响。

方法

体外分离培养BALB/c小鼠心肌细胞，采用柯萨奇病毒B3 （CVB3）感染心肌细胞，建立病毒性心肌炎细胞模型，将细胞分为对照组（未感染CVB3病毒）、CVB3组（感染CVB3病毒）、CVB3+miR-NC组（感染CVB3病毒，转染miR-NC）、CVB3+miR-942-5p组（感染CVB3病毒，转染miR-942-5p）、CVB3+si-NC组（感染CVB3病毒，转染si-NC）、CVB3+si-TRAF6组（感染CVB3病毒，转染si-TRAF6）、CVB3+miR-942-5p+pcDNA组（感染CVB3病毒，转染miR-942-5p和pcDNA）和CVB3+miR-942-5p+TRAF6组（感染CVB3病毒，转染miR-942-5p和TRAF6）。采用实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测细胞中miR-942-5p和TRAF6 mRNA的表达；蛋白免疫印迹法（Western blot）检测TRAF6、B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）和B细胞淋巴瘤/白血病-2相关蛋白X （Bax）蛋白表达水平；噻唑蓝比色法（MTT）检测细胞活力；流式细胞术检测细胞凋亡情况；ELISA检测肿瘤坏死因子（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）的表达；双荧光素酶报告实验验证miR-942-5p和TRAF6的关系。两组间比较采用独立样本t检验。

结果

与对照组相比，CVB3组的miR-942-5p表达量（0.97±0.06比0.36±0.03）、细胞活力（98.10﹪±8.67﹪比44.61﹪±5.30﹪）、Bcl-2蛋白表达（0.93±0.06比0.38±0.03）均降低；TRAF6 mRNA （0.96±0.08比2.14±0.21）和蛋白表达（0.86±0.07比1.69±0.17）、细胞凋亡率（8.92﹪±1.13﹪比26.27﹪±2.24﹪）、Bax蛋白表达（0.94±0.06比1.67±0.156）、TNF-α（56.70±5.56比97.62±8.89）、IL-1β （38.42±4.01比86.91±8.09）均升高，差异有统计学意义（P均< 0.05）；与CVB3+miR-NC组比较，CVB3+miR-942-5p组细胞活力（41.24﹪±4.71﹪比65.32﹪±5.81﹪）、Bcl-2蛋白表达（0.41±0.04比0.64±0.05）均升高，细胞凋亡率（25.67﹪±1.19﹪比14.22﹪±1.46﹪）、Bax蛋白表达（1.70±0.16比1.29±0.12）、TNF-α （103.68±9.82比78.44±6.68）、IL-1β （81.27±7.81比57.43±4.78）均降低（P均< 0.05）；与CVB3+si-NC组比较，CVB3+si-TRAF6组细胞活力（50.32﹪±4.94﹪比68.32﹪±6.44﹪）、Bcl-2蛋白表达（0.39±0.04比0.63±0.05）均升高，细胞凋亡率（23.86﹪±1.82﹪比16.34﹪±1.27﹪）、Bax蛋白表达（1.73±0.15比1.26±0.15）、TNF-α （86.08±8.04比63.42±5.89）、IL-1β （74.48±6.88比55.64±5.18）均升高（P均<0.05）。miR-942-5p可以靶向TRAF6的表达，过表达TRAF6可以逆转过表达miR-942-5p对CVB3诱导的病毒性心肌炎细胞的活力、凋亡和炎症反应的影响。

结论

miR-942-5p可以通过靶向调控TRAF6的表达减轻CVB3感染心肌细胞的凋亡和炎症反应。

关键词: miR-942-5p, TRAF6, 病毒性心肌炎, 凋亡, 炎症反应
Objective

To investigate the effect of miR-942-5p on viral myocarditis cell injury by targeting tumor necrosis receptor related factor 6 (TRAF6) .

Method

The cardiomyocytes of BALB/c mice were isolated and cultured in vitro, and Coxsackievirus B3 (CVB3) was used to infect cardiomyocytes to establish a viral myocarditis cell model, the cells were divided into Con group (no CVB3 virusinfected) and CVB3 group (CVB3 virusinfected) , CVB3+miR-NC group (CVB3 virusinfected and miR-NC transfected) , CVB3+miR-942-5p group (CVB3 virusinfected and miR-942-5ptransfected) , CVB3+si-NC group (CVB3 virusinfectedandsi-NC transfected) , CVB3+si-TRAF6 group (CVB3 virusinfected and si-TRAF6 transfected) , CVB3+miR-942-5p+ pcDNA group (CVB3 virusinfected, miR-942-5p and pcDNA transfected) and CVB3+miR-942-5p+ TRAF6 group (CVB3 virusinfected, miR-942-5p and TRAF6 transfected) . Then Real-time quantitative polymerase chain reaction (qRT-PCR) was used to detect the expression of miR-942-5p and TRAF6 mRNA. Western blot detected the expression of TRAF6, B-cell lymphoma/leukemia-2 (Bcl-2) and B-cell lymphoma/leukemia-2 related protein X (Bax) protein. Thiazole blue colorimetry (MTT) detected cell viability. Apoptosis was assessed by flow cytometry. ELISA was used to detect tumor necrosis factor (TNF-α) , interleukin-1β (IL-1β) expression and dual luciferase report experiment verified the relationship between miR-942-5p and TRAF6. The independent sample t test was used for the comparison between the two groups.

Result

Compared with the Con group, the expression of miR-942-5p (0.97±0.06 vs 0.36±0.03) , cell viability[ (98.10±8.67) ﹪ vs (44.61±5.30) ﹪, (97.51±8.89) ﹪ vs (46.69±5.42) ﹪], and Bcl-2 (0.93±0.06 vs 0.38±0.03, 0.92±0.06 vs 0.41±0.03) protein expression in CVB3 group were significantly reduced. TRAF6 mRNA (0.96±0.08 to 2.14±0.21) and protein expression (0.86±0.07 vs 1.69±0.17) , apoptosis rate [ (8.92±1.13) ﹪ vs (26.27±2.24) ﹪, (7.20±0.94) ﹪ vs (24.58±2.12) ﹪], Bax (0.94±0.06 vs 1.67±0.15, 0.98±0.07 vs 1.77±0.16) protein expression, TNF-α (56.70±5.56 vs 97.62±8.89, 48.52±4.68 vs 81.24±7.67) , IL-1β (38.42±4.01 vs 86.91±8.09, 33.21±4.06 vs 77.39±7.21) were significantly increased. Overexpression of miR-942-5p or interference with TRAF6 can significantly increase cell viability [ (41.24±4.71) ﹪ vs (65.32±5.81) ﹪, (50.23±4.94) ﹪ vs (68.32±6.44) ﹪], Bcl-2 (0.41±0.04 vs 0.64±0.05, 0.39±0.04 vs 0.63±0.05) protein expression, and reduce cell apoptosis rate[ (25.67±1.91) ﹪ vs (14.22±1.46) ﹪, (23.86±1.82) ﹪ vs (16.34±1.27) ﹪], Bax (1.70±0.16 vs 1.29±0.12, 1.73±0.15 vs 1.26±0.15) protein expression, TNF-α (103.68±9.82 vs 78.42±6.68, 86.08±8.04 vs 63.42±5.89) , IL-1β (81.27±7.81 vs 57.43±4.78, 74.48±6.88 vs 55.64±5.18) . miR-942-5p can target the expression of TRAF6, and overexpression of TRAF6 can reverse the miR-942-5p overexpression effecton the viability, apoptosis and inflammatory response of viral myocarditis cells induced by CVB3.

Conclusion

miR-942-5p can target apoptosis and inflammation in CVB3 infected cardiomyocytes by targeting TRAF6 expression.

Key words: miR-942-5p, TRAF6, Viral myocarditis, Apoptosis, Inflammatory response
表1 引物序列信息
引物名称 序列（5'→3'） 预期扩增产物长度（bp）
miR-942-5p 上游AGGGTCTTCTCTGTTTTGGC 129
  下游GTTGTGGTTGGTTGGTTTGT  
  RT GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACC ACAT  
U6 上游CTCGCTTCGGCAGCACA 105
  下游AACGCTTCACGAATTTGCGT  
TRAF6 上游GCCCATGCCGTATGAAGAGA 212
  下游ACTGAATGTGCAGGGGACTG  
β-actin 上游CACCCGCGAGTACAACCTTC 154
  下游CCCATACCCACCCATCACACC  
图1 TRAF6在CVB3感染心肌细胞后的蛋白表达
表2 miR-942-5p和TRAF6在CVB3感染心肌细胞后的表达（ ± s）
分组 实验次数 miR-942-5p TRAF6 mRNA TRAF6蛋白
对照 3 0.97±0.06 0.96±0.08 0.86±0.07
CVB3 3 0.36±0.03 2.14±0.21 1.69±0.17
t值   15.750 9.095 7.820
P值   <0.001 0.001 0.001
图2 过表达miR-942-5p对CVB3感染心肌细胞凋亡的影响
表3 过表达miR-942-5p对CVB3感染心肌细胞凋亡和炎症反应的影响（ ± s）
分组 实验次数 miR-942-5p 细胞活力（﹪） 细胞凋亡率（﹪） Bcl-2 Bax TNF-α IL-1β
对照 3 0.99±0.07 98.10±8.67 8.92±1.13 0.93±0.06 0.94±0.06 56.70±5.56 38.42±4.01
CVB3 3 0.40±0.04 44.61±5.30 26.27±2.24 0.38±0.03 1.67±0.15 97.62±8.89 86.91±8.09
t值   12.675 9.117 11.978 14.201 7.826 6.759 9.302
P值   < 0.001 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 0.002 0.001
CVB3+miR-NC 3 0.38±0.03 41.24±4.71 25.67±1.91 0.41±0.04 1.70±0.16 103.68±9.82 81.27±7.81
CVB3+miR-942-5p 3 0.62±0.05 65.32±5.81 14.22±1.46 0.64±0.05 1.29±0.12 78.44±6.68 57.43±4.78
t值   7.129 5.576 8.249 6.222 3.551 3.681 4.510
P值   0.002 0.005 0.001 0.003 0.024 0.021 0.011
图3 干扰TRAF6对CVB3感染心肌细胞凋亡的影响
表4 干扰TRAF6对CVB3感染心肌细胞凋亡和炎症反应的影响（ ± s）
分组 实验次数 TRAF6 mRNA TRAF6蛋白 细胞活力（﹪） 细胞凋亡率（﹪） Bcl-2 Bax TNF-α IL-1β
对照 3 0.97±0.07 0.83±0.06 97.51±8.89 7.20±0.94 0.92±0.06 0.98±0.07 48.52±4.68 33.21±4.06
CVB3 3 2.19±0.22 1.62±0.15 46.69±5.42 24.58±2.12 0.41±0.03 1.77±0.16 81.24±7.67 77.39±7.22
t值   9.153 8.470 8.454 12.981 13.168 7.835 6.307 9.238
P值   0.001 0.001 0.001 < 0.001 < 0.001 0.001 0.003 0.001
CVB3+si-NC 3 2.23±0.24 1.57±0.14 50.32±4.94 23.86±1.82 0.39±0.04 1.73±0.15 86.08±8.04 74.48±6.88
CVB3+si-TRAF6 3 1.56±0.14 1.32±0.11 68.32±6.44 16.34±1.27 0.63±0.05 1.26±0.15 63.42±5.89 55.64±5.18
t值   4.177 2.808 3.841 5.869 6.492 3.838 3.938 3.789
P值   0.014 0.031 0.018 0.004 0.003 0.018 0.017 0.019
图4 miR-942-5p和TRAF6存在互补的核苷酸序列
表5 双荧光素酶报告实验（ ± s）
分组 实验次数 TRAF6-WT TRAF6-MUT
miR-NC 3 0.99±0.07 0.99±0.06
miR-942-5p 3 0.40±0.04 1.03±0.09
t值   12.675 0.641
P值   < 0.001 0.557
图5 过表达TRAF6可以逆转过表达miR-942-5p对CVB3感染心肌细胞凋亡的影响
表6 过表达TRAF6可以逆转过表达miR-942-5p对CVB3感染心肌细胞凋亡和炎症反应的影响（ ± s）
分组 实验次数 TRAF6 mRNA TRAF6蛋白 细胞活力（﹪） 细胞凋亡率（﹪） Bcl-2 Bax TNF-α IL-1β
CVB3+miR-942-5p+pcDNA 3 1.63±0.06 1.38±0.07 68.72±6.26 14.78±1.42 0.67±0.06 1.33±0.12 80.60±7.18 53.24±4.82
CVB3+miR-942-5p+TRAF6 3 2.54±0.03 1.93±0.04 51.32±4.88 18.41±1.57 0.46±0.05 1.69±0.14 105.36±8.12 68.47±5.33
t值   23.496 11.816 3.797 2.970 4.657 3.382 3.957 3.671
P值   <0.001 <0.001 0.019 0.041 0.010 0.028 0.017 0.021
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