MiR-3202对高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞损伤的影响

doi:10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2021.03.004

目的

探讨微小RNA-3202 （miR-3202）对高糖诱导人视网膜血管内皮细胞（HRCEC）凋亡的影响及其潜在的分子机制。

方法

体外培养HRCEC，分为低糖组、高糖组、高糖+miR-NC组、高糖+miR-3202组、高糖+si-NC组、高糖+si-ILK组、高糖+miR-3202+pcDNA3.1组和高糖+miR-3202+ pcDNA3.1-ILK组。采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）与Western blot法测定HRCEC中miR-3202、整合素连接激酶（ILK）的表达；流式细胞术测定细胞凋亡率；双荧光素酶报告基因实验与Western blot实验验证miR-3202与ILK的靶向调控作用；Western blot测定HRCEC中Bax和Bcl-2蛋白的表达。采用两样本t检验进行统计学分析。

结果

与低糖组比较，高糖组HRCEC中miR-3202的表达水平（0.95±0.09比0.21±0.02）降低，ILK的表达水平（0.30±0.03比0.86±0.08）、细胞凋亡率（8.54%±1.03%比28.53%±3.25%）均升高，差异具有统计学意义（P均< 0.05）；与高糖+ miR-NC组比较，高糖+ miR-3202组细胞凋亡率（28.86%±2.45%比12.67%±1.15%）、Bax的表达水平（1.12±0.11比0.36±0.03）均下降，Bcl-2的表达水平（0.23±0.02比0.77±0.07）升高，差异具有统计学意义（P均< 0.05）；与高糖+ si-NC组比较，高糖+ si-ILK组细胞凋亡率（28.86%±2.45%比13.46%±1.24%）、Bax的表达水平（1.10±0.11比0.47±0.05）均降低，Bcl-2的表达水平（0.23±0.02比0.64±0.06）上升，差异具有统计学意义（P均< 0.05）；miR-3202可负向调控靶基因ILK的表达，ILK过表达可逆转miR-3202对高糖诱导的HRCEC凋亡的作用。

结论

miR-3202可通过下调ILK的表达而抑制高糖诱导的HRCEC凋亡。

关键词: miR-3202, 整合素连接激酶, 糖尿病视网膜病变, 凋亡

Objective

To investigate the effect of microRNA-3202 (miR-3202) on apoptosis induced by high glucose in human retinal vascular endothelial cells (HRCEC) and its molecular mechanisms.

Methods

HRCEC was cultured in vitro and divided into eight groups, including low glucose group, high glucose group, high glucose+miR-NC group, high glucose+miR-3202 group, high glucose+si-NC group, high glucose+si-ILK group, high sugar + miR -3202+pcDNA3.1 group, high glucose+miR-3202+pcDNA3.1-ILK group. The expression of miR-3202 and ILK in HRCEC was determined by real-time quantitative PCR (qRT-PCR) and Western blot, and the apoptotic rate was determined by flow cytometry. The dual luciferase reporter gene assay and Western blot assay were used to verified the relationship between miR-3202 and ILK. Also, The expression of Bax and Bcl-2 protein in HRCEC was determined by Western blot.

Results

Compared with the low glucose group, the expression level of miR-3202 in the HRCEC of the high glucose group was significantly decreased (0.95±0.09 vs 0.21±0.02, P < 0.05), and the expression level of ILK (0.30±0.03 vs 0.86±0.08) and the rate of cell apoptosis were significantly increased (8.54%±1.03% vs 28.53%± 3.25%, P < 0.05). Compared with the high glucose + miR-NC group, the apoptotic rate of the high glucose + miR-3202 group (28.86%±2.45% vs 12.67%±1.15%) and the expression level of Bax were significantly decreased (1.12±0.11 vs 0.36±0.03, P < 0.05), however,the expression level of Bcl-2 significantly increased (0.23±0.02 vs 0.77±0.07, P < 0.05). Compared with the high glucose + si-NC group, the apoptotic rate of the high glucose + si-ILK group (28.86%±2.45% vs 13.46%±1.24%, P < 0.05) and the expression level of Bax were both significantly decreased (1.10±0.11 vs 0.47±0.05, P < 0.05), while the expression level of Bcl-2 was significantly increased (0.23±0.02 vs 0.64±0.06, P < 0.05). MiR-3202 may negatively regulate the expression of the target gene ILK. Overexpression of ILK reversed the effect of miR-3202 on high glucose-induced apoptosis of HRCEC.

Conclusion

high glucose can induce the apoptosis of HRCEC and miR-3202 may inhibit it by down-regulating the expression of ILK.

Key words: miR-3202, Integrin-linked kinase, Diabetic retinopathy, Apoptosis

表1 引物序列信息

基因	序列（5'→3'）	预期扩增产物长度（bp）
miR-3202	上游ATGGAAGGGAGAAGAGC	120
	下游GCTCGTCTCTGATCTCGCG
	RT TGGAAGGGAGAAGAGCTTTATATAAAG
U6	上游ATTGGAACGATACAGAGAAGATT	96
U6	下游GGAACGCTTCACGAATTTG	96

表1 引物序列信息

基因	序列（5'→3'）	预期扩增产物长度（bp）
miR-3202	上游ATGGAAGGGAGAAGAGC	120
	下游GCTCGTCTCTGATCTCGCG
	RT TGGAAGGGAGAAGAGCTTTATATAAAG
U6	上游ATTGGAACGATACAGAGAAGATT	96
U6	下游GGAACGCTTCACGAATTTG	96

图1 高糖对人视网膜血管内皮细胞凋亡的影响

表2 miR-3202和ILK在高糖作用的人视网膜血管内皮细胞中的表达（±s）

分组	实验次数	miR-3202	ILK蛋白
低糖	6	0.95±0.09	0.30±0.03
高糖	6	0.21±0.02	0.86±0.08
t值		19.661	16.055
P值		<0.001	<0.001

表2 miR-3202和ILK在高糖作用的人视网膜血管内皮细胞中的表达（±s）

分组	实验次数	miR-3202	ILK蛋白
低糖	6	0.95±0.09	0.30±0.03
高糖	6	0.21±0.02	0.86±0.08
t值		19.661	16.055
P值		<0.001	<0.001

图2 ILK在高糖作用的人视网膜血管内皮细胞中的表达

表3 过表达miR-3202对高糖作用的人视网膜血管内皮细胞凋亡的影响（±s）

分组	实验次数	miR-3202	Bax蛋白	Bcl-2蛋白	凋亡率（%）
高糖+miR-NC	6	0.20±0.02	1.12±0.11	0.23±0.02	28.86±2.45
高糖+miR-3202	6	0.83±0.08	0.36±0.03	0.77±0.07	12.67±1.15
t值		18.714	16.327	18.169	14.653
P值		<0.001	<0.001	<0.001	<0.001

表3 过表达miR-3202对高糖作用的人视网膜血管内皮细胞凋亡的影响（±s）

分组	实验次数	miR-3202	Bax蛋白	Bcl-2蛋白	凋亡率（%）
高糖+miR-NC	6	0.20±0.02	1.12±0.11	0.23±0.02	28.86±2.45
高糖+miR-3202	6	0.83±0.08	0.36±0.03	0.77±0.07	12.67±1.15
t值		18.714	16.327	18.169	14.653
P值		<0.001	<0.001	<0.001	<0.001

图3 过表达miR-3202对高糖作用的人视网膜血管内皮细胞凋亡的影响

表4 双荧光素酶实验（±s）

分组	实验次数	WT-ILK	MUT-ILK
miR-NC	6	1.00±0.09	0.96±0.09
miR-3202	6	0.31±0.03	1.01±0.09
t值		17.816	0.962
P值		<0.001	0.359

表4 双荧光素酶实验（±s）

分组	实验次数	WT-ILK	MUT-ILK
miR-NC	6	1.00±0.09	0.96±0.09
miR-3202	6	0.31±0.03	1.01±0.09
t值		17.816	0.962
P值		<0.001	0.359

图4 miR-3202和ILK的互补序列

图5 ILK蛋白的相对表达

表5 抑制ILK对高糖作用的人视网膜血管内皮细胞凋亡的影响（±s）

分组	实验次数	ILK蛋白	Bax蛋白	Bcl-2蛋白	凋亡率（%）
高糖+si-NC	6	0.90±0.09	1.10±0.11	0.23±0.02	28.86±2.45
高糖+si-ILK	6	0.41±0.04	0.47±0.05	0.64±0.06	13.46±1.24
t值		12.187	12.771	15.897	13.738
P值		< 0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001

表5 抑制ILK对高糖作用的人视网膜血管内皮细胞凋亡的影响（±s）

分组	实验次数	ILK蛋白	Bax蛋白	Bcl-2蛋白	凋亡率（%）
高糖+si-NC	6	0.90±0.09	1.10±0.11	0.23±0.02	28.86±2.45
高糖+si-ILK	6	0.41±0.04	0.47±0.05	0.64±0.06	13.46±1.24
t值		12.187	12.771	15.897	13.738
P值		< 0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001

图6 抑制ILK对高糖作用的人视网膜血管内皮细胞中Bax、Bcl-2蛋白表达的影响

表6 过表达ILK能逆转miR-3202对高糖作用的细胞HRCEC凋亡的影响（±s）

分组	实验次数	ILK蛋白	Bax蛋白	Bcl-2蛋白	凋亡率（%）
高糖+miR-NC	6	0.84±0.08	1.12±0.11	0.23±0.02	28.86±2.45
高糖+miR-3202	6	0.23±0.02	0.36±0.03	0.77±0.07	12.67±1.15
t值		16.207	16.327	18.169	14.653
P值		< 0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001
高糖+miR-3202+pcDNA3.1	6	0.21±0.02	0.34±0.03	0.78±0.07	12.53±1.13
高糖+miR-3202+ pcDNA3.1-ILK	6	0.56±0.05	0.79±0.08	0.43±0.04	23.61±2.27
t值		15.920	12.901	10.634	10.703
P值		< 0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001

表6 过表达ILK能逆转miR-3202对高糖作用的细胞HRCEC凋亡的影响（±s）

分组	实验次数	ILK蛋白	Bax蛋白	Bcl-2蛋白	凋亡率（%）
高糖+miR-NC	6	0.84±0.08	1.12±0.11	0.23±0.02	28.86±2.45
高糖+miR-3202	6	0.23±0.02	0.36±0.03	0.77±0.07	12.67±1.15
t值		16.207	16.327	18.169	14.653
P值		< 0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001
高糖+miR-3202+pcDNA3.1	6	0.21±0.02	0.34±0.03	0.78±0.07	12.53±1.13
高糖+miR-3202+ pcDNA3.1-ILK	6	0.56±0.05	0.79±0.08	0.43±0.04	23.61±2.27
t值		15.920	12.901	10.634	10.703
P值		< 0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001

图7 过表达ILK能逆转miR-3202对高糖作用的人视网膜血管内皮细胞凋亡蛋白表达的影响

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