脐带间充质干细胞联合UM171对脐血源CD34<sup>+</sup>细胞的扩增效果研究

doi:10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2017.02.006

目的

研究脐带间充质干细胞联合UM171对脐血来源CD34⁺细胞的扩增效果。

方法

脐血来源CD34⁺细胞及脐带来源间充质干细胞分为以下4组进行体外扩增培养10 d：对照组、UM171培养组、间充质干细胞共培养组、UM171联合间充质干细胞共培养组，采用方差分析比较不同组别间细胞扩增倍数及流式表型和集落培养情况。

结果

脐带间充质干细胞CD105，CD73，CD90，不表达CD14，CD34，CD19，CD45，HLA-DR，经过诱导可以向成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞分化。CD34⁺细胞在不同条件下体外培养10 d后，UM171培养组总有核细胞数扩增14倍，CD34⁺细胞扩增13.5倍；MSCs共培养组总有核细胞数扩增11倍，CD34⁺细胞扩增10倍；联合培养组总有核细胞数扩增达22倍，CD34⁺细胞扩增21倍。联合培养组扩增后细胞CD34⁺ CD38^-比例达（91.49±2.67）﹪，较间充质干细胞培养组（78.11±2.35）﹪及UM171培养组（91.49±2.68）﹪相比差异具有统计学意义（P均< 0.01）。扩增后细胞集落培养14 d后，各系集落形成良好，UM171扩增组细胞较MSCs扩增组在红系及粒系形成能力方面存在优势。

结论

脐带血间充质干细胞作为细胞滋养层可提高CD34⁺细胞体外扩增效果，UM171在扩增过程中可较好的保持细胞干性，二者联合应用扩增效果最佳，建立的脐带间充质干细胞联合UM171对脐血源CD34⁺细胞的扩增方法可用于CD34⁺细胞体外扩增培养。

关键词: 间质干细胞, CD34⁺, 造血干细胞, 脐血

Objective

To investigate the effect of umbilical cord mesenchymal stem cells (MSCs) in combination with UM171 on amplification of cord blood CD34⁺cells.

Methods

The cord blood CD34⁺cells and umbilical cord MSCs were divided into four groups: Group A (control group) , Group B (UM171 culture group) , Group C (MSCs co-culture group) and Group D (UM171 and MSCs co-culture group) . The cell number, phenotype and colony formation ability were compared among different groups after amplification in vitro for 10 days.

Results

The umbilical cord MSCs expressed CD105, CD73 and CD90, while didn't express CD14, CD34, CD19, CD45 and HLA-DR. After induction, the cells could differentiate into osteoblasts, adipocytes and chondrocytes. After the CD34⁺cells were culturedin vitrofor 10 days, the total nuclear cells in the UM171 culture group were amplified by 14 times, and CD34⁺cells by 13.5 times; the total nuclear cells in the MSCs co-culture group were amplified by 11 times, and CD34⁺cells by 10 times; the total nuclear cells in the UM171 and MSCs co-culture group were amplified by 22 times, and CD34⁺cells by 21 times.The ratio of CD34⁺CD38^-cell in the UM171 and MSCs co-culture group was (91.49±2.67) ﹪. There was significant difference compared with the UM171 culture group (91.49±2.68) ﹪and the MSCs co-culture group (78.11±2.35) ﹪. After amplification, the cells were cultured for 14 days, and colony formation were observed in all groups. Besides, cells in the UM171 group formed more erythroid cells and granulocytes than cells in the MSC co-culture group.

Conclusion

As feeder cells, umbilical cord MSCs can improvein vitroamplification of CD34⁺cells. UM171 can favorably maintain stemness of the cells in the amplification process. The optimal amplification can be achieved by combining umbilical cord MSCs and UM171.

Key words: Mesenchymal Stem Cells, CD34⁺, Hematopoietic stem cells, Fetal blood

图1 倒置显微镜下观察MSCs及CD34⁺细胞培养形态

图2 流式细胞仪对MSCs表面抗原检测结果

图3 光学显微镜下观察MSCs分化诱导成像（×200）

图4 各组培养过程不同时间点细胞总数变化情况

表1 培养后各组细胞总数、CD34⁺及CD133⁺细胞数比较（×10⁵， ± s）

分组	例数	细胞总数	CD34⁺	CD133⁺（×10⁵）
对照组	6	3.76±0.43	3.57±0.36	0.28±0.07
UM171组	6	14.33±0.68	13.50±0.92	5.47±1.03
MSCs组	6	11.69±1.52	10.27±1.28	2.73±0.42
UM171及MSC共培养组	6	21.91±1.39	21.17±1.43	8.38±3.11
F值	?	274.38	272.43	26.82
P值	?	< 0.01	< 0.01	< 0.01

表1 培养后各组细胞总数、CD34⁺及CD133⁺细胞数比较（×10⁵， ± s）

分组	例数	细胞总数	CD34⁺	CD133⁺（×10⁵）
对照组	6	3.76±0.43	3.57±0.36	0.28±0.07
UM171组	6	14.33±0.68	13.50±0.92	5.47±1.03
MSCs组	6	11.69±1.52	10.27±1.28	2.73±0.42
UM171及MSC共培养组	6	21.91±1.39	21.17±1.43	8.38±3.11
F值	?	274.38	272.43	26.82
P值	?	< 0.01	< 0.01	< 0.01

表2 培养后各组细胞流式表型比较（﹪， ± s）

分组	例数	CD34⁺CD38^-	CD34⁺CD38⁺	CD34^-CD38⁺	CD34^-CD38^-	CD133⁺
对照组	6	72.44±12.47	22.70±1.88	2.88±0.39	1.91±0.37	7.61± 1.62
UM171组	6	87.67± 1.48	6.44±3.23	0.99±0.58	4.84±2.57	38.40± 8.24
MSCs组	6	78.11± 2.35	9.83±1.43	2.88±0.73	2.44±0.79	23.46± 3.29
UM171及MSC共培养组	6	91.49± 2.68	5.12±1.66	0.95±0.42	5.52±3.28	38.55±15.07
F值	?	86.87	82.48	24.35	35.13	16.90
P值	?	< 0.01	< 0.01	< 0.01	< 0.01	< 0.01

表2 培养后各组细胞流式表型比较（﹪， ± s）

分组	例数	CD34⁺CD38^-	CD34⁺CD38⁺	CD34^-CD38⁺	CD34^-CD38^-	CD133⁺
对照组	6	72.44±12.47	22.70±1.88	2.88±0.39	1.91±0.37	7.61± 1.62
UM171组	6	87.67± 1.48	6.44±3.23	0.99±0.58	4.84±2.57	38.40± 8.24
MSCs组	6	78.11± 2.35	9.83±1.43	2.88±0.73	2.44±0.79	23.46± 3.29
UM171及MSC共培养组	6	91.49± 2.68	5.12±1.66	0.95±0.42	5.52±3.28	38.55±15.07
F值	?	86.87	82.48	24.35	35.13	16.90
P值	?	< 0.01	< 0.01	< 0.01	< 0.01	< 0.01

图6 细胞凋亡流式检测

图7 倒置显微镜下观察各谱系集落形成（×200）

表3 扩增前后各组细胞集落培养结果比较（ ± s）

分组	例数	CFU-E	CFU-GM	CFU-GEMM
未扩增脐血组	6	28.33±4.32	84.17± 9.87	10.33±3.72
UM171组	6	35.17±7.99	73.83±16.58	13.00±2.83
MSCs组	6	19.17±3.60	51.00± 9.69	7.00±2.35
UM171及MSC共培养组	6	35.33±6.38	82.50± 7.87	13.50±3.83
F值	?	10.25	10.59	4.36
P值	?	< 0.01	0.02	< 0.01

表3 扩增前后各组细胞集落培养结果比较（ ± s）

分组	例数	CFU-E	CFU-GM	CFU-GEMM
未扩增脐血组	6	28.33±4.32	84.17± 9.87	10.33±3.72
UM171组	6	35.17±7.99	73.83±16.58	13.00±2.83
MSCs组	6	19.17±3.60	51.00± 9.69	7.00±2.35
UM171及MSC共培养组	6	35.33±6.38	82.50± 7.87	13.50±3.83
F值	?	10.25	10.59	4.36
P值	?	< 0.01	0.02	< 0.01

图5 各组细胞培养后流式检测情况

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