人脐带间充质干细胞对小鼠实验性溃疡性结肠炎的疗效

doi:10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2017.02.005

目的

探讨人脐带间充质干细胞移植术对溃疡性结肠炎（UC）小鼠的疗效，以及对血清中肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素-8（IL-8）水平的影响。

方法

选用雄性小鼠48只，完全随机分为正常对照组、模型对照组、脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）治疗组，每组16只。模型对照组与hUC-MSCs治疗组通过口服5﹪葡聚糖硫酸钠诱导UC模型。对hUC-MSCs治疗组小鼠经尾静脉注射脐带间充质干细胞。观察各组疾病活动指数评分；采用酶联免疫吸附（ELISA）法测量各组小鼠血清中TNF-α、IL-8的表达水平，各组数据两组比较采用t检验，多组比较使用重复测量资料的方差分析对结果进行统计分析。

结果

模型对照组与hUC-MSCs治疗组DAI评分从第2天开始上升，直至实验结束分别为8.72±0.71、4.01±0.35均高于正常对照组0.21±0.20，且差异有统计学意义（F = 1 300.66，P < 0.01）；模型对照组与hUC-MSCs治疗组比较，在造模期间及治疗的第4天DAI评分分别为7.95±0.71、8.01±0.73，差异无统计学意义（t =-?0.24，P = 0.08），在治疗的第5天hUC-MSCs治疗组DAI评分开始下降为7.23±0.82，且与模型对照组8.01±0.81相比，差异有统计学意义（t =-?2.71，P = 0.01）。造模第7天，模型对照组与hUC-MSCs治疗组两组TNF-α分别为（363.32±15.84）pg/ml、（375.52±16.21）pg/ml，均高于空白对照组（112.14±11.23）pg/ml（F = 624.12，P < 0.01）；模型对照组与hUC-MSCs治疗组两组IL-8分别为（65.32±10.12）pg/ml、（57.21±8.71）pg/ml均高于空白对照组（25.02±7.81）pg/ml（F = 34.29，P < 0.01），但两组比较差异无统计学意义（P > 0.05）；第2次干细胞注射7 d后即实验结束时，模型对照组与hUC-MSCs治疗组TNF-α分别为（453.23±15.63）pg/ml、（276.84±17.91）pg/ml，仍高于空白对照组（134.32±12.31）pg/ml（F = 642.41，P < 0.01）；模型对照组与hUC-MSCs治疗组两组IL-8分别为（75.23±6.72）pg/ml、（39.12±4.42）pg/ml仍高于空白对照组（27.12±5.91）pg/ml（F = 113.90，P < 0.01），但hUC-MSCs治疗组水平较造模结束时有所下降，低于模型对照组（P < 0.05）。

结论

间充质干细胞移植术对UC小鼠有良好的治疗作用，且能降低血清中TNF-α、IL-8的水平。

关键词: 结肠炎，溃疡性, 脐带, 间质干细胞, 肿瘤坏死因子α, 白细胞介素8

Objective

To investigate human umbilical cord derived mesenchymal stem cells (hUC-MSCs) transplantation for the treatment of ulcerative colitis (UC) in mice, and evaluated the effect of hUC-MSCs on tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) and interleukin-8 (IL-8) production.

Methods

Forty eight male adult mice were randomly divided into three groups, namely normal control group, model control group and hUC-MSC group, with 16 mice in each group. UC was induced by drinking 5﹪dextran sulfate sodium (DSS) . The hUC-MSC group was treated by i.v. hUC-MSCs cells through tail vein. The disease activity index (DAI) was evaluated and TNF-αand IL-8 were detected by ELISA.t-test was used to determine statistical significance between the two groups, and ANOVA was used among the three groups.

Results

The DAI began to rise at the second day for the model control group and the hUC-MSCs group, which were (8.72±0.71) and (4.01±0.35) respectively at the end of the experiment, both higher than the normal control group (0.21±0.20,F= 1 300.66,P = 0.000) . The DAI were not different between the model control group and the hUC-MSCs group at the 4 days after induction of UC (7.95±0.71vs8.01±0.73,t=-0.236,P= 0.08153) . The DAI of the hUC-MSCs group began to decrease at the 5th treatment day and was lower than that of the model control group (7.23±0.82vs8.01±0.81,t=-2.707,P= 0.0111) . TNF-αlevels of the model control group (363.32±15.84) pg/ml and the hUC-MSCs group (375.52±16.21) pg/ml were similar (P> 0.05) , but higher than that of the normal group (112.14±11.23) pg/ml at the 7th day (F= 624.12,P= 0.000) ; IL-8 level of the model control group (65.32±10.12) pg/ml and the hUC-MSCs group (57.21±8.71) pg/ml were similar (P> 0.05) , but higher than that of the normal group (25.02±7.81) pg/ml at the 7th day (F= 34.29,P= 0.000) . Seven days after the second injection of stem cells (the end of experiment) , TNF-αlevel of the model control group (453.23±15.63) pg/ml and the hUC-MSCs group (276.84±17.91) pg/ml were higher than that of the normal group[ (134.32±12.31) pg/ml,F= 642.41,P= 0.000]; IL-8 level of the model control group (75.23±6.72) pg/ml and the hUC-MSCs group (39.12±4.42) pg/ml were higher than that of the normal group[ (27.12±5.91) pg/ml,F= 113.90,P= 0.000], but TNF-αand IL-8 levels of the hUC-MSCs group were lower than that of the model group (P< 0.05) .

Conclusion

hUC-MSCs may alleviate UC in DSS-treated mice via decreasing production of TNF-αand IL-8.

Key words: Colitis, ulcerative, Umbilical cord, Mesenchymal stem cells, Tumor necrosis factor-alpha, Interleukin-8

表1 DAI评分标准

体重降低率^a	大便性状	血便	评分
无变化	成形	正常	0
1﹪~ 5﹪	半成型，不黏附肛门	无明显可见出血	1
5﹪~ 10﹪	半成型，黏附肛门	有明显可见出血	2
10﹪~ 20﹪	水样	血便	3
20﹪以上	—	—	4

表1 DAI评分标准

体重降低率^a	大便性状	血便	评分
无变化	成形	正常	0
1﹪~ 5﹪	半成型，不黏附肛门	无明显可见出血	1
5﹪~ 10﹪	半成型，黏附肛门	有明显可见出血	2
10﹪~ 20﹪	水样	血便	3
20﹪以上	—	—	4

图1 普通光显微镜下观察人脐带间充质干细胞形态（×100）

表2 hUC-MSCs移植术后各组小鼠DAI评分表（n = 16， ± s）

分组	第1天	第2天	第3天	第4天	第5天	第6天	第7天	第8天	第9天
正常对照组	0.28±0.07	0.31±0.23	0.35±0.21	0.29±0.22	0.21±0.19	0.34±0.23	0.43±0.26	0.37±0.21	0.39±0.25
模型对照组	0.26±0.03	2.01±0.07^a	3.91±0.12^a	4.12±0.23^a	5.13±0.34^a	6.08±0.44^a	6.67±0.51^a	7.23±0.61^a	7.47±0.71^a
治疗组	0.31±0.02	1.68±0.06^a	3.47±0.14^a	4.33±0.25^a	5.52±0.31^a	6.43±0.46^a	6.55±0.48^a	7.12±0.59^a	7.63±0.67^a
F值	0.00	635.28	2 781.59	1 515.73	1 696.68	1 225.20	1 112.72	969.61	808.03
P值	> 0.05	< 0.01	< 0.01	< 0.01	< 0.01	< 0.01	< 0.01	< 0.01	< 0.01
分组	第10天	第11天	第12天	第13天	第14天	第15天	第16天	第17天
正常对照组	0.44±0.24	0.16±0.12	0.19±0.12	0.22±0.16	0.35±0.25	0.32±0.23	0.24±0.22	0.21±0.20
模型对照组	7.65±0.67^a	7.95±0.71^a	8.01±0.81^a	8.23±0.82^a	8.43±0.79^a	8.54±0.68^a	8.61±0.65^a	8.72±0.71^a
治疗组	7.83±0.65^a	8.01±0.73^a	7.23±0.82^ab	6.91±0.61^ab	5.53±0.54^ab	5.01±0.43^ab	4.23±0.37^ab	4.01±0.35^ab
F值	918.22	930.65	663.18	827.28	822.15	1 165.67	1 384.16	1 300.66
P值	< 0.01	< 0.01	< 0.01	< 0.01	< 0.01	< 0.01	< 0.01	< 0.01

表2 hUC-MSCs移植术后各组小鼠DAI评分表（n = 16， ± s）

分组	第1天	第2天	第3天	第4天	第5天	第6天	第7天	第8天	第9天
正常对照组	0.28±0.07	0.31±0.23	0.35±0.21	0.29±0.22	0.21±0.19	0.34±0.23	0.43±0.26	0.37±0.21	0.39±0.25
模型对照组	0.26±0.03	2.01±0.07^a	3.91±0.12^a	4.12±0.23^a	5.13±0.34^a	6.08±0.44^a	6.67±0.51^a	7.23±0.61^a	7.47±0.71^a
治疗组	0.31±0.02	1.68±0.06^a	3.47±0.14^a	4.33±0.25^a	5.52±0.31^a	6.43±0.46^a	6.55±0.48^a	7.12±0.59^a	7.63±0.67^a
F值	0.00	635.28	2 781.59	1 515.73	1 696.68	1 225.20	1 112.72	969.61	808.03
P值	> 0.05	< 0.01	< 0.01	< 0.01	< 0.01	< 0.01	< 0.01	< 0.01	< 0.01
分组	第10天	第11天	第12天	第13天	第14天	第15天	第16天	第17天
正常对照组	0.44±0.24	0.16±0.12	0.19±0.12	0.22±0.16	0.35±0.25	0.32±0.23	0.24±0.22	0.21±0.20
模型对照组	7.65±0.67^a	7.95±0.71^a	8.01±0.81^a	8.23±0.82^a	8.43±0.79^a	8.54±0.68^a	8.61±0.65^a	8.72±0.71^a
治疗组	7.83±0.65^a	8.01±0.73^a	7.23±0.82^ab	6.91±0.61^ab	5.53±0.54^ab	5.01±0.43^ab	4.23±0.37^ab	4.01±0.35^ab
F值	918.22	930.65	663.18	827.28	822.15	1 165.67	1 384.16	1 300.66
P值	< 0.01	< 0.01	< 0.01	< 0.01	< 0.01	< 0.01	< 0.01	< 0.01

表3 造模第7天及实验结束时各组小鼠细胞因子TNF-α、IL-8与CRP水平（ ± s）

分组	只数	TNF-α（pg/ml）		IL-8（pg/ml）		CRP（mg/ml）
分组	只数	造模第7天	实验结束	造模第7天	实验结束	造模第7天	实验结束
空白对照组	6	112.14±11.23	134.32±12.31	25.02± 7.81	27.12±5.91	0.35±0.12	0.41±0.13
模型对照组	6	363.32±15.84^a	453.23±15.63^a	65.32±10.12^a	75.23±6.72^a	1.57±0.18^a	1.43±0.16^a
治疗组	6	375.52±16.21^a	276.84±17.91^ab	57.21± 8.71^a	39.12±4.42^ab	1.62±0.15^a	0.88±0.21^ab
F值	?	624.12	642.41	34.29	113.90	134.36	54.17
P值	?	< 0.01	< 0.01	< 0.01	< 0.01	< 0.01	< 0.01

表3 造模第7天及实验结束时各组小鼠细胞因子TNF-α、IL-8与CRP水平（ ± s）

分组	只数	TNF-α（pg/ml）		IL-8（pg/ml）		CRP（mg/ml）
分组	只数	造模第7天	实验结束	造模第7天	实验结束	造模第7天	实验结束
空白对照组	6	112.14±11.23	134.32±12.31	25.02± 7.81	27.12±5.91	0.35±0.12	0.41±0.13
模型对照组	6	363.32±15.84^a	453.23±15.63^a	65.32±10.12^a	75.23±6.72^a	1.57±0.18^a	1.43±0.16^a
治疗组	6	375.52±16.21^a	276.84±17.91^ab	57.21± 8.71^a	39.12±4.42^ab	1.62±0.15^a	0.88±0.21^ab
F值	?	624.12	642.41	34.29	113.90	134.36	54.17
P值	?	< 0.01	< 0.01	< 0.01	< 0.01	< 0.01	< 0.01

图2 光学显微镜下观察各实验组小鼠结肠组织病理照片（HE染色，×200）

图3 荧光显微镜下观察hUC-MSCs在结肠定位情况（PKH26染色）

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Curative effect of human umbilical cord mesenchymal stem cells on ulcerative colitis mice

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