蟛蜞菊内酯上调miR-190表达抑制高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞凋亡

doi:10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2023.06.003

目的

探讨蟛蜞菊内酯（WEL）对高糖（HG）诱导的人视网膜血管内皮细胞（HRECs）损伤的影响和分子机制。

方法

采用低（10 μmol/L ）、中（20 μmol/L ）、高（40 μmol/ L）剂量WEL（WEL-L、WEL-M、WEL-H）处理或miR-190模拟物/抑制剂转染HRECs后，用30 mmol/L葡萄糖孵育HRECs 24 h建立细胞损伤模型。试剂盒检测细胞中活性氧（ROS）水平、超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量；流式细胞测量术分析细胞凋亡；RT- qPCR检测miR-190表达。采用独立样本t检验和单因素方差分析进行统计学差异比较。

结果

WEL-L、WEL-M、WEL-H处理可降低HG诱导的HRECs凋亡率[（24.22 ± 2.16）%、（17.17 ± 1.19）%、（9.89 ± 0.86）%比（31.67 ± 3.02）%]、MDA含量、ROS水平，升高miR- 190表达（0.42 ± 0.04、0.59 ± 0.04、0.72 ± 0.06比0.28 ± 0.03）和SOD活性（P < 0.01）。过表达miR-190降低HG诱导的HRECs凋亡率[（12.98 ± 1.06）%比（32.28 ± 3.03）%]、MDA含量、ROS水平，增高SOD活性（P < 0.01）。下调miR-190逆转了WEL对HG诱导的HRECs凋亡率[（25.57 ± 2.49）%比（9.79 ± 0.87）%]、MDA含量、ROS水平及SOD活性的影响（P < 0.01）。

结论

蟛蜞菊内酯减轻HG诱导的HRECs氧化应激损伤和凋亡，其机制与上调miR-190有关。

关键词: 蟛蜞菊内酯, 视网膜血管内皮细胞, 凋亡, 氧化应激, miR-190

Objective

To investigate the effects and molecular mechanisms of wedelolactone (WEL) on injury of human retinal vascular endothelial cells (HRECs) induced by high glucose (HG) .

Methods

After being treated with low (10 μmol/L), medium (20 μmol/ L) and high (40 μmol/ L) doses of WEL (WEL-L, WEL-M and WEL-H) or transfected with miR- 190 mimics/ inhibitors, the cell injury model was established by incubating HRECs with 30 mmol/L glucose for 24 h. The kit was used to detect cellular reactive oxygen species (ROS), superoxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA) content; cell apoptosis was analyzed by flow cytometry; miR-190 expression was detected by RT-qPCR. Independent sample t test and one-way analysis of variance were used for statistical comparison.

Results

Low, medium and high doses of WEL could reduce HG induced apoptosis rate of HRECs [ (24.22 ± 2.16) %, (17.17 ± 1.19) %, (9.89 ± 0.86) % vs (31.67 ± 3.02) %], MDA content and ROS level, and increased the expression of miR-190 (0.28 ± 0.03 vs 0.42 ± 0.04, 0.59 ± 0.04, 0.72 ± 0.06) and SOD activity (P < 0.01). Overexpression of miR- 190 decreased apoptosis rate [ (32.28 ± 3.03) % vs (12.98 ± 1.06) %], MDA content and ROS level of HRECs induced by HG, and increased SOD activity (P < 0.01). Down-regulation of miR-190 reversed the effects of WEL on apoptosis rate [ (9.79 ± 0.87) % vs (25.57 ± 2.49) %], MDA content, ROS level and SOD activity of HRECs induced by HG (P < 0.01) .

Conclusion

Wedelolactone alleviates oxidative stress injury and apoptosis of HRECs induced by HG, and the mechanism is related to up-regulation miR-190.

Key words: Wedelolactone, Retinal vascular endothelial cells, Apoptosis, Oxidative stress, MiR-190

表1 引物序列信息

基因	序列（5'→3'）	预期扩增产物长度（bp）
U6（内参）	上游GCGCGTCGTGAAGCGTTC	98
	下游GTGCAGGGTCCGAGGT
miR-190	上游GGTCTTTGATGATGATTCTGG	75
	下游CTAGGCACAGTATTGAAGGTT

表1 引物序列信息

基因	序列（5'→3'）	预期扩增产物长度（bp）
U6（内参）	上游GCGCGTCGTGAAGCGTTC	98
	下游GTGCAGGGTCCGAGGT
miR-190	上游GGTCTTTGATGATGATTCTGG	75
	下游CTAGGCACAGTATTGAAGGTT

表2 蟛蜞菊内酯对高糖诱导HRECs氧化应激的影响（

±s）

分组	实验次数	ROS水平（%）	SOD活性（U/mg）	MDA含量（nmol/mg）
对照	3	100.00 ± 0.00	127.70 ± 11.52	3.15 ± 0.37
HG	3	340.74 ± 20.77^a	34.86 ± 3.52^a	19.96 ± 1.58^a
HG+WEL-L	3	265.01 ± 21.56^b	61.52 ± 5.08^b	14.98 ± 1.12^b
HG+WEL-M	3	203.85 ± 16.55^bc	81.62 ± 6.36^bc	10.15 ± 0.87^bc
HG+WEL-H	3	136.91 ± 14.25^bcd	101.79 ± 10.33^bcd	5.21 ± 0.48^bcd
F值		308.830	181.117	441.948
P值		< 0.001	< 0.001	< 0.001

表2 蟛蜞菊内酯对高糖诱导HRECs氧化应激的影响（

±s）

分组	实验次数	ROS水平（%）	SOD活性（U/mg）	MDA含量（nmol/mg）
对照	3	100.00 ± 0.00	127.70 ± 11.52	3.15 ± 0.37
HG	3	340.74 ± 20.77^a	34.86 ± 3.52^a	19.96 ± 1.58^a
HG+WEL-L	3	265.01 ± 21.56^b	61.52 ± 5.08^b	14.98 ± 1.12^b
HG+WEL-M	3	203.85 ± 16.55^bc	81.62 ± 6.36^bc	10.15 ± 0.87^bc
HG+WEL-H	3	136.91 ± 14.25^bcd	101.79 ± 10.33^bcd	5.21 ± 0.48^bcd
F值		308.830	181.117	441.948
P值		< 0.001	< 0.001	< 0.001

表3 蟛蜞菊内酯对高糖诱导HRECs凋亡的影响（

±s）

分组	实验次数	凋亡率（%）	cleaved caspase-3	cleaved caspase-9
Con	3	6.83 ± 0.59	0.22 ± 0.02	0.12 ± 0.02
HG	3	31.67 ± 3.02^a	0.71 ± 0.06^a	0.58 ± 0.04^a
HG+WEL-L	3	24.22 ± 2.16^b	0.57 ± 0.04^b	0.41 ± 0.03^b
HG+WEL-M	3	17.17 ± 1.19^bc	0.43 ± 0.04^bc	0.29 ± 0.03^bc
HG+WEL-H	3	9.89 ± 0.86^bcd	0.31 ± 0.03^bcd	0.17 ± 0.02^bcd
F值		287.833	215.111	372.107
P值		< 0.01	< 0.01	< 0.01

表3 蟛蜞菊内酯对高糖诱导HRECs凋亡的影响（

±s）

分组	实验次数	凋亡率（%）	cleaved caspase-3	cleaved caspase-9
Con	3	6.83 ± 0.59	0.22 ± 0.02	0.12 ± 0.02
HG	3	31.67 ± 3.02^a	0.71 ± 0.06^a	0.58 ± 0.04^a
HG+WEL-L	3	24.22 ± 2.16^b	0.57 ± 0.04^b	0.41 ± 0.03^b
HG+WEL-M	3	17.17 ± 1.19^bc	0.43 ± 0.04^bc	0.29 ± 0.03^bc
HG+WEL-H	3	9.89 ± 0.86^bcd	0.31 ± 0.03^bcd	0.17 ± 0.02^bcd
F值		287.833	215.111	372.107
P值		< 0.01	< 0.01	< 0.01

图1 蟛蜞菊内酯对高糖诱导HRECs凋亡的影响注：a ~ e图分别为对照、HG、HG+WEL-L、HG+WEL-M、HG+WELl-H

图2 cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白表达条带

图3 蟛蜞菊内酯对高糖诱导的HRECs miR-190表达的影响注：与对照比较，^aP < 0.01；与HG比较，^bP < 0.01 ；与HG+WEL-L比较，^cP < 0.01；与HG+WEL-M比较，^dP < 0.01

表4 miR-190过表达对高糖诱导HRECs氧化应激的影响（

±s）

分组	实验次数	miR-190	ROS水平（%）	SOD活性（U/mg）	MDA含量（nmol/mg）
HG+miR-NC	3	1.00 ± 0.00	344.30 ± 25.63	36.61 ± 3.19	20.49 ± 1.73
HG+miR-190	3	3.31 ± 0.22	157.45 ± 14.36	87.91 ± 8.54	7.15 ± 0.64
t值		31.500	19.080	16.882	21.696
P值		< 0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001

表4 miR-190过表达对高糖诱导HRECs氧化应激的影响（

±s）

分组	实验次数	miR-190	ROS水平（%）	SOD活性（U/mg）	MDA含量（nmol/mg）
HG+miR-NC	3	1.00 ± 0.00	344.30 ± 25.63	36.61 ± 3.19	20.49 ± 1.73
HG+miR-190	3	3.31 ± 0.22	157.45 ± 14.36	87.91 ± 8.54	7.15 ± 0.64
t值		31.500	19.080	16.882	21.696
P值		< 0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001

表5 过表达miR-190对高糖诱导HRECs凋亡的影响（

±s）

分组	实验次数	凋亡率（%）	cleaved caspase-3	cleaved caspase-9
HG+miR-NC	3	32.28 ± 3.03	0.73 ± 0.01	0.59 ± 0.04
HG+miR-190	3	12.98 ± 1.06	0.40 ± 0.04	0.27 ± 0.03
t值		18.037	15.461	19.200
P值		< 0.01	< 0.01	< 0.01

表5 过表达miR-190对高糖诱导HRECs凋亡的影响（

±s）

分组	实验次数	凋亡率（%）	cleaved caspase-3	cleaved caspase-9
HG+miR-NC	3	32.28 ± 3.03	0.73 ± 0.01	0.59 ± 0.04
HG+miR-190	3	12.98 ± 1.06	0.40 ± 0.04	0.27 ± 0.03
t值		18.037	15.461	19.200
P值		< 0.01	< 0.01	< 0.01

图4 过表达miR-190对高糖诱导HRECs凋亡的影响注：a图HG+miR-NC，b图为HG+miR-190；c图为Western blot检测cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白表达

表6 下调miR-190恢复了蟛蜞菊内酯对高糖诱导HRECs损伤的作用（

±s）

分组	实验次数	miR-190	ROS水平（%）	SOD活性（U/mg）	MDA含量（nmol/mg）
HG+WEL+anti-miR-NC	3	1.00 ± 0.00	130.33 ± 11.38	105.81 ± 10.31	5.01 ± 0.47
HG+WEL+anti-miR-190	3	0.49 ± 0.04	297.92 ± 23.69	46.61 ± 4.27	15.98 ± 1.26
t值		38.250	19.130	15.915	24.472
P值		< 0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001
分组	实验次数	凋亡率（%）	cleaved caspase-3	cleaved caspase-9
HG+WEL+anti-miR-NC	3	9.79 ± 0.87	0.32 ± 0.03	0.15 ± 0.02
HG+WEL+anti-miR-190	3	25.57 ± 2.49	0.60 ± 0.04	0.45 ± 0.04
t值		17.948	16.800	20.125
P值		< 0.01	< 0.01	< 0.01

表6 下调miR-190恢复了蟛蜞菊内酯对高糖诱导HRECs损伤的作用（

±s）

分组	实验次数	miR-190	ROS水平（%）	SOD活性（U/mg）	MDA含量（nmol/mg）
HG+WEL+anti-miR-NC	3	1.00 ± 0.00	130.33 ± 11.38	105.81 ± 10.31	5.01 ± 0.47
HG+WEL+anti-miR-190	3	0.49 ± 0.04	297.92 ± 23.69	46.61 ± 4.27	15.98 ± 1.26
t值		38.250	19.130	15.915	24.472
P值		< 0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001
分组	实验次数	凋亡率（%）	cleaved caspase-3	cleaved caspase-9
HG+WEL+anti-miR-NC	3	9.79 ± 0.87	0.32 ± 0.03	0.15 ± 0.02
HG+WEL+anti-miR-190	3	25.57 ± 2.49	0.60 ± 0.04	0.45 ± 0.04
t值		17.948	16.800	20.125
P值		< 0.01	< 0.01	< 0.01

图5 下调miR-190恢复了蟛蜞菊内酯对高糖诱导HRECs凋亡的作用注：a图为HG+WEL+anti-miR-NC，b图为HG+WEL+anti-miR-190；c图为Western blot检测cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白表达

1	Martinez B, Peplow PV. MicroRNAs as biomarkers of diabetic retinopathy and disease progression[J]. Neural Regen Res, 2019, 14(11):1858-1869.
2	Lechner J, O’Leary OE, Stitt AW. The pathology associated with diabetic retinopathy[J]. Vision Res, 2017, 139(1):7-14.
3	Peng YG, Zhang L. Wedelolactone suppresses cell proliferation and migration through AKT and AMPK signaling in melanoma[J]. J Dermatolog Treat, 2019, 30(4):389-395.
4	许静，陈杰，孙萍萍，等. 蟛蜞菊内酯抗大鼠肝缺血再灌注损伤作用的研究[J]. 时珍国医国药, 2014, 25(9):2058-2059.
5	陈杰，许静，罗子玲，等. 蟛蜞菊内酯对脂多糖诱导RAW264.7细胞IL-6、TNF-α及NF-κB的影响[J]. 时珍国医国药, 2012, 23(9):2166-2168.
6	Shahab U, Faisal M, Alatar AA, et al. Impact of wedelolactone in the anti-glycation and anti-diabetic activity in experimental diabetic animals[J]. IUBMB Life, 2018, 70(6):547-552.
7	许静，陈杰，罗子玲. 蟛蜞菊内酯对过氧化氢诱导人冠状动脉内皮细胞氧化损伤的保护作用[J]. 中国临床药理学杂志, 2019, 35(10):103-106.
8	Li X, Yu ZW, Wang Y, et al. MicroRNAs: Potential targets in diabetic retinopathy[J]. Horm Metab Res, 2020, 52(3):142-148.
9	Lu H, Yang J, Li J, et al. MiR-190 ameliorates glucotoxicity-induced dysfunction and apoptosis of pancreatic β-cells by inhibiting NOX2-mediated reactive oxygen species production[J]. PeerJ, 2022, 10:e13849.
10	Zhang Q, Xiao X, Zheng J, et al. Vildagliptin, a dipeptidyl peptidase-4 inhibitor, attenuated endothelial dysfunction through miRNAs in diabetic rats[J]. Arch Med Sci, 2019, 17(5):1378-1387.
11	张梅，李春霞，韦芳，等. 石斛酚对高糖诱导的人视网膜微血管内皮细胞的保护作用[J]. 国际眼科杂志, 2019, 19(2): 40-44.
12	Li Q, Pang L, Shi H, et al. High glucose concentration induces retinal endothelial cell apoptosis by activating p53 signaling pathway[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2018, 11(5):2401-2407.
13	Liu L, Xu H, Zhao H, et al. STEAP4 inhibits HIF-1α/PKM2 signaling and reduces high glucose-induced apoptosis of retinal vascular endothelial cells[J]. Diabetes Metab Syndr Obes, 2020, 13(1):2573-2582.
14	Zhu MM, Wang L, Yang D, et al. Wedelolactone alleviates doxorubicin-induced inflammation and oxidative stress damage of podocytes by IκK/IκB/NF-κB pathway[J]. Biomed Pharmacother, 2019, 117(1):109088-109098.
15	Ding S, Hou X, Yuan J, et al. Wedelolactone protects human bronchial epithelial cell injury against cigarette smoke extract-induced oxidant stress and inflammation responses through Nrf2 pathway[J]. Int Immunopharmacol, 2015, 29(2):648-655.
16	陈平，魏雪梅，谈丽丽. 莫诺苷调控miR-483-5p表达对高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞氧化应激和凋亡影响[J]. 中国临床解剖学杂志, 2023, 41(4):434-439.
17	Hwang SJ, Ahn BJ, Shin MW, et al. miR-125a-5p attenuates macrophage-mediated vascular dysfunction by targeting Ninjurin1[J]. Cell Death Differ, 2022, 29(6):1199-1210.
18	Rezazadeh-Gavgani E, Oladghaffari M, Bahramian S, et al. MicroRNA-21: A critical underestimated molecule in diabetic retinopathy[J]. Gene, 2023, 859:147212.
19	黎昌江，陈方安，洪娟，等. miR-155靶向Nrf2/HO-1通路对高糖作用下视网膜血管内皮细胞氧化应激损伤的影响[J]. 东南大学学报(医学版), 2021, 40(5):666-674.
20	Yu Y, Cao XC. miR-190-5p in human diseases[J]. Cancer Cell Int, 2019, 19(1): 257-267.
21	Sun Q, Wang S, Chen J, et al. MicroRNA-190 alleviates neuronal damage and inhibits neuroinflammation via Nlrp3 in MPTP-induced Parkinson’s disease mouse model[J]. J Cell Physiol, 2019, 234(12): 23379-23387.
22	Jiang C, Dong N, Feng J, et al. MiRNA-190 exerts neuroprotective effects against ischemic stroke through Rho/Rho-kinase pathway[J]. Pflugers Arch, 2021, 473(1): 121-130.
23	Zhai CL, Tang GM, Qian G, et al. miR-190 protects cardiomyocytes from apoptosis induced by H2O2 through targeting MAPK8 and regulating MAPK8/ERK signal pathway[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2018, 11(4):2183-2192.
24	Liu C, Ren Y, Sui X, et al. Integrating network pharmacology, transcriptomics, and molecular simulation to reveal the mechanism of tert-butylhydroquinone for treating diabetic retinopathy[J]. Eur J Pharmacol, 2022, 931:175215.

[1]	钟雅雯, 王煜, 王海臻, 黄莉萍. 肌苷通过抑制线粒体通透性转换孔开放缓解缺氧/复氧诱导的人绒毛膜滋养层细胞凋亡[J/OL]. 中华妇幼临床医学杂志(电子版), 2024, 20(05): 525-533.
[2]	李嘉兴, 孙乙文, 李文星. NLRP3炎性小体在急性胰腺炎中作用的研究进展[J/OL]. 中华普通外科学文献(电子版), 2024, 18(04): 300-304.
[3]	唐亦骁, 陈峻, 连正星, 胡海涛, 鲁迪, 徐骁, 卫强. 白果内酯对小鼠肝缺血再灌注损伤保护作用研究[J/OL]. 中华移植杂志(电子版), 2024, 18(05): 278-282.
[4]	胡思平, 熊性宇, 徐航, 杨璐. 衰老相关分泌表型因子在前列腺癌发生发展中的作用机制[J/OL]. 中华腔镜泌尿外科杂志(电子版), 2024, 18(05): 425-434.
[5]	郑俊, 吴杰英, 谭海波, 郑安全, 李腾成. EGFR-MEK-TZ三联合分子的构建及其对去势抵抗性前列腺癌细胞增殖与凋亡的影响[J/OL]. 中华腔镜泌尿外科杂志(电子版), 2024, 18(05): 503-508.
[6]	李勇, 彭天明, 王倩倩, 陈育纯, 蒲小勇, 刘久敏. 基于失巢凋亡相关基因的膀胱癌预后模型构建及分析[J/OL]. 中华腔镜泌尿外科杂志(电子版), 2024, 18(04): 331-339.
[7]	张璇, 高杨, 房雅君, 姚艳玲. 保护性机械通气在肺癌胸腔镜肺段切除术中的临床应用[J/OL]. 中华肺部疾病杂志(电子版), 2024, 17(04): 563-567.
[8]	黄程鑫, 陈莉, 刘伊楚, 王水良, 赖晓凤. OPA1 在乳腺癌组织的表达特征及在ER阳性乳腺癌细胞中的生物学功能研究[J/OL]. 中华细胞与干细胞杂志(电子版), 2024, 14(05): 275-284.
[9]	杜霞, 马梦青, 曹长春. 造影剂诱导的急性肾损伤的发病机制及干预靶点研究进展[J/OL]. 中华肾病研究电子杂志, 2024, 13(05): 279-282.
[10]	李佳曦, 刘子源, 李学民. 二甲双胍对年龄相关性白内障影响的研究进展[J/OL]. 中华眼科医学杂志(电子版), 2024, 14(04): 252-256.
[11]	李京, 牛博, 刘晓蓓, 魏新雪, 黄荣. circ-SESN2 沉默靶向调控miRNA-23a-5p/ULK1 在神经细胞氧化应激损伤中的作用机制研究[J/OL]. 中华神经创伤外科电子杂志, 2024, 10(05): 263-272.
[12]	冯铭, 孙洪涛. 动脉瘤性蛛网膜下腔出血的颅内压监测与管理[J/OL]. 中华神经创伤外科电子杂志, 2024, 10(04): 248-253.
[13]	王国强, 张纲, 唐建坡, 张玉国, 杨永江. LINC00839 调节miR-17-5p/WEE1 轴对结直肠癌细胞增殖、凋亡和迁移的影响[J/OL]. 中华消化病与影像杂志(电子版), 2024, 14(06): 491-499.
[14]	靳英, 付小霞, 陈美茹, 袁璐, 郝力瑶. CD147调控MAPK信号通路对结肠癌细胞增殖和凋亡的影响及机制研究[J/OL]. 中华临床医师杂志(电子版), 2024, 18(05): 474-480.
[15]	刘霖, 张文欢, 宋雅茹, 姜云璐. Apelin-13 在阿尔茨海默病中的神经保护作用机制研究进展[J/OL]. 中华诊断学电子杂志, 2024, 12(04): 276-280.

阅读次数

全文

摘要

选择文件类型/文献管理软件名称

选择包含的内容

Wedelolctone upregulates miR-190 expression to inhibit human retinal vascular endothelial cell apoptosis induced by high glucose

模态框（Modal）标题

选择文件类型/文献管理软件名称

选择包含的内容

Wedelolctone upregulates miR-190 expression to inhibit human retinal vascular endothelial cell apoptosis induced by high glucose