蟛蜞菊内酯上调miR-190表达抑制高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞凋亡

doi:10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2023.06.003

目的

探讨蟛蜞菊内酯（WEL）对高糖（HG）诱导的人视网膜血管内皮细胞（HRECs）损伤的影响和分子机制。

方法

采用低（10 μmol/L ）、中（20 μmol/L ）、高（40 μmol/ L）剂量WEL（WEL-L、WEL-M、WEL-H）处理或miR-190模拟物/抑制剂转染HRECs后，用30 mmol/L葡萄糖孵育HRECs 24 h建立细胞损伤模型。试剂盒检测细胞中活性氧（ROS）水平、超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量；流式细胞测量术分析细胞凋亡；RT- qPCR检测miR-190表达。采用独立样本t检验和单因素方差分析进行统计学差异比较。

结果

WEL-L、WEL-M、WEL-H处理可降低HG诱导的HRECs凋亡率[（24.22 ± 2.16）%、（17.17 ± 1.19）%、（9.89 ± 0.86）%比（31.67 ± 3.02）%]、MDA含量、ROS水平，升高miR- 190表达（0.42 ± 0.04、0.59 ± 0.04、0.72 ± 0.06比0.28 ± 0.03）和SOD活性（P < 0.01）。过表达miR-190降低HG诱导的HRECs凋亡率[（12.98 ± 1.06）%比（32.28 ± 3.03）%]、MDA含量、ROS水平，增高SOD活性（P < 0.01）。下调miR-190逆转了WEL对HG诱导的HRECs凋亡率[（25.57 ± 2.49）%比（9.79 ± 0.87）%]、MDA含量、ROS水平及SOD活性的影响（P < 0.01）。

结论

蟛蜞菊内酯减轻HG诱导的HRECs氧化应激损伤和凋亡，其机制与上调miR-190有关。

关键词: 蟛蜞菊内酯, 视网膜血管内皮细胞, 凋亡, 氧化应激, miR-190

Objective

To investigate the effects and molecular mechanisms of wedelolactone (WEL) on injury of human retinal vascular endothelial cells (HRECs) induced by high glucose (HG) .

Methods

After being treated with low (10 μmol/L), medium (20 μmol/ L) and high (40 μmol/ L) doses of WEL (WEL-L, WEL-M and WEL-H) or transfected with miR- 190 mimics/ inhibitors, the cell injury model was established by incubating HRECs with 30 mmol/L glucose for 24 h. The kit was used to detect cellular reactive oxygen species (ROS), superoxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA) content; cell apoptosis was analyzed by flow cytometry; miR-190 expression was detected by RT-qPCR. Independent sample t test and one-way analysis of variance were used for statistical comparison.

Results

Low, medium and high doses of WEL could reduce HG induced apoptosis rate of HRECs [ (24.22 ± 2.16) %, (17.17 ± 1.19) %, (9.89 ± 0.86) % vs (31.67 ± 3.02) %], MDA content and ROS level, and increased the expression of miR-190 (0.28 ± 0.03 vs 0.42 ± 0.04, 0.59 ± 0.04, 0.72 ± 0.06) and SOD activity (P < 0.01). Overexpression of miR- 190 decreased apoptosis rate [ (32.28 ± 3.03) % vs (12.98 ± 1.06) %], MDA content and ROS level of HRECs induced by HG, and increased SOD activity (P < 0.01). Down-regulation of miR-190 reversed the effects of WEL on apoptosis rate [ (9.79 ± 0.87) % vs (25.57 ± 2.49) %], MDA content, ROS level and SOD activity of HRECs induced by HG (P < 0.01) .

Conclusion

Wedelolactone alleviates oxidative stress injury and apoptosis of HRECs induced by HG, and the mechanism is related to up-regulation miR-190.

Key words: Wedelolactone, Retinal vascular endothelial cells, Apoptosis, Oxidative stress, MiR-190

表1 引物序列信息

基因	序列（5'→3'）	预期扩增产物长度（bp）
U6（内参）	上游GCGCGTCGTGAAGCGTTC	98
	下游GTGCAGGGTCCGAGGT
miR-190	上游GGTCTTTGATGATGATTCTGG	75
	下游CTAGGCACAGTATTGAAGGTT

表1 引物序列信息

基因	序列（5'→3'）	预期扩增产物长度（bp）
U6（内参）	上游GCGCGTCGTGAAGCGTTC	98
	下游GTGCAGGGTCCGAGGT
miR-190	上游GGTCTTTGATGATGATTCTGG	75
	下游CTAGGCACAGTATTGAAGGTT

表2 蟛蜞菊内酯对高糖诱导HRECs氧化应激的影响（

±s）

分组	实验次数	ROS水平（%）	SOD活性（U/mg）	MDA含量（nmol/mg）
对照	3	100.00 ± 0.00	127.70 ± 11.52	3.15 ± 0.37
HG	3	340.74 ± 20.77^a	34.86 ± 3.52^a	19.96 ± 1.58^a
HG+WEL-L	3	265.01 ± 21.56^b	61.52 ± 5.08^b	14.98 ± 1.12^b
HG+WEL-M	3	203.85 ± 16.55^bc	81.62 ± 6.36^bc	10.15 ± 0.87^bc
HG+WEL-H	3	136.91 ± 14.25^bcd	101.79 ± 10.33^bcd	5.21 ± 0.48^bcd
F值		308.830	181.117	441.948
P值		< 0.001	< 0.001	< 0.001

表2 蟛蜞菊内酯对高糖诱导HRECs氧化应激的影响（

±s）

分组	实验次数	ROS水平（%）	SOD活性（U/mg）	MDA含量（nmol/mg）
对照	3	100.00 ± 0.00	127.70 ± 11.52	3.15 ± 0.37
HG	3	340.74 ± 20.77^a	34.86 ± 3.52^a	19.96 ± 1.58^a
HG+WEL-L	3	265.01 ± 21.56^b	61.52 ± 5.08^b	14.98 ± 1.12^b
HG+WEL-M	3	203.85 ± 16.55^bc	81.62 ± 6.36^bc	10.15 ± 0.87^bc
HG+WEL-H	3	136.91 ± 14.25^bcd	101.79 ± 10.33^bcd	5.21 ± 0.48^bcd
F值		308.830	181.117	441.948
P值		< 0.001	< 0.001	< 0.001

表3 蟛蜞菊内酯对高糖诱导HRECs凋亡的影响（

±s）

分组	实验次数	凋亡率（%）	cleaved caspase-3	cleaved caspase-9
Con	3	6.83 ± 0.59	0.22 ± 0.02	0.12 ± 0.02
HG	3	31.67 ± 3.02^a	0.71 ± 0.06^a	0.58 ± 0.04^a
HG+WEL-L	3	24.22 ± 2.16^b	0.57 ± 0.04^b	0.41 ± 0.03^b
HG+WEL-M	3	17.17 ± 1.19^bc	0.43 ± 0.04^bc	0.29 ± 0.03^bc
HG+WEL-H	3	9.89 ± 0.86^bcd	0.31 ± 0.03^bcd	0.17 ± 0.02^bcd
F值		287.833	215.111	372.107
P值		< 0.01	< 0.01	< 0.01

表3 蟛蜞菊内酯对高糖诱导HRECs凋亡的影响（

±s）

分组	实验次数	凋亡率（%）	cleaved caspase-3	cleaved caspase-9
Con	3	6.83 ± 0.59	0.22 ± 0.02	0.12 ± 0.02
HG	3	31.67 ± 3.02^a	0.71 ± 0.06^a	0.58 ± 0.04^a
HG+WEL-L	3	24.22 ± 2.16^b	0.57 ± 0.04^b	0.41 ± 0.03^b
HG+WEL-M	3	17.17 ± 1.19^bc	0.43 ± 0.04^bc	0.29 ± 0.03^bc
HG+WEL-H	3	9.89 ± 0.86^bcd	0.31 ± 0.03^bcd	0.17 ± 0.02^bcd
F值		287.833	215.111	372.107
P值		< 0.01	< 0.01	< 0.01

图1 蟛蜞菊内酯对高糖诱导HRECs凋亡的影响注：a ~ e图分别为对照、HG、HG+WEL-L、HG+WEL-M、HG+WELl-H

图2 cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白表达条带

图3 蟛蜞菊内酯对高糖诱导的HRECs miR-190表达的影响注：与对照比较，^aP < 0.01；与HG比较，^bP < 0.01 ；与HG+WEL-L比较，^cP < 0.01；与HG+WEL-M比较，^dP < 0.01

表4 miR-190过表达对高糖诱导HRECs氧化应激的影响（

±s）

分组	实验次数	miR-190	ROS水平（%）	SOD活性（U/mg）	MDA含量（nmol/mg）
HG+miR-NC	3	1.00 ± 0.00	344.30 ± 25.63	36.61 ± 3.19	20.49 ± 1.73
HG+miR-190	3	3.31 ± 0.22	157.45 ± 14.36	87.91 ± 8.54	7.15 ± 0.64
t值		31.500	19.080	16.882	21.696
P值		< 0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001

表4 miR-190过表达对高糖诱导HRECs氧化应激的影响（

±s）

分组	实验次数	miR-190	ROS水平（%）	SOD活性（U/mg）	MDA含量（nmol/mg）
HG+miR-NC	3	1.00 ± 0.00	344.30 ± 25.63	36.61 ± 3.19	20.49 ± 1.73
HG+miR-190	3	3.31 ± 0.22	157.45 ± 14.36	87.91 ± 8.54	7.15 ± 0.64
t值		31.500	19.080	16.882	21.696
P值		< 0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001

表5 过表达miR-190对高糖诱导HRECs凋亡的影响（

±s）

分组	实验次数	凋亡率（%）	cleaved caspase-3	cleaved caspase-9
HG+miR-NC	3	32.28 ± 3.03	0.73 ± 0.01	0.59 ± 0.04
HG+miR-190	3	12.98 ± 1.06	0.40 ± 0.04	0.27 ± 0.03
t值		18.037	15.461	19.200
P值		< 0.01	< 0.01	< 0.01

表5 过表达miR-190对高糖诱导HRECs凋亡的影响（

±s）

分组	实验次数	凋亡率（%）	cleaved caspase-3	cleaved caspase-9
HG+miR-NC	3	32.28 ± 3.03	0.73 ± 0.01	0.59 ± 0.04
HG+miR-190	3	12.98 ± 1.06	0.40 ± 0.04	0.27 ± 0.03
t值		18.037	15.461	19.200
P值		< 0.01	< 0.01	< 0.01

图4 过表达miR-190对高糖诱导HRECs凋亡的影响注：a图HG+miR-NC，b图为HG+miR-190；c图为Western blot检测cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白表达

表6 下调miR-190恢复了蟛蜞菊内酯对高糖诱导HRECs损伤的作用（

±s）

分组	实验次数	miR-190	ROS水平（%）	SOD活性（U/mg）	MDA含量（nmol/mg）
HG+WEL+anti-miR-NC	3	1.00 ± 0.00	130.33 ± 11.38	105.81 ± 10.31	5.01 ± 0.47
HG+WEL+anti-miR-190	3	0.49 ± 0.04	297.92 ± 23.69	46.61 ± 4.27	15.98 ± 1.26
t值		38.250	19.130	15.915	24.472
P值		< 0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001
分组	实验次数	凋亡率（%）	cleaved caspase-3	cleaved caspase-9
HG+WEL+anti-miR-NC	3	9.79 ± 0.87	0.32 ± 0.03	0.15 ± 0.02
HG+WEL+anti-miR-190	3	25.57 ± 2.49	0.60 ± 0.04	0.45 ± 0.04
t值		17.948	16.800	20.125
P值		< 0.01	< 0.01	< 0.01

表6 下调miR-190恢复了蟛蜞菊内酯对高糖诱导HRECs损伤的作用（

±s）

分组	实验次数	miR-190	ROS水平（%）	SOD活性（U/mg）	MDA含量（nmol/mg）
HG+WEL+anti-miR-NC	3	1.00 ± 0.00	130.33 ± 11.38	105.81 ± 10.31	5.01 ± 0.47
HG+WEL+anti-miR-190	3	0.49 ± 0.04	297.92 ± 23.69	46.61 ± 4.27	15.98 ± 1.26
t值		38.250	19.130	15.915	24.472
P值		< 0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001
分组	实验次数	凋亡率（%）	cleaved caspase-3	cleaved caspase-9
HG+WEL+anti-miR-NC	3	9.79 ± 0.87	0.32 ± 0.03	0.15 ± 0.02
HG+WEL+anti-miR-190	3	25.57 ± 2.49	0.60 ± 0.04	0.45 ± 0.04
t值		17.948	16.800	20.125
P值		< 0.01	< 0.01	< 0.01

图5 下调miR-190恢复了蟛蜞菊内酯对高糖诱导HRECs凋亡的作用注：a图为HG+WEL+anti-miR-NC，b图为HG+WEL+anti-miR-190；c图为Western blot检测cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白表达

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Wedelolctone upregulates miR-190 expression to inhibit human retinal vascular endothelial cell apoptosis induced by high glucose

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