miR-148/152家族调控内皮细胞糖酵解相关基因的表达分析

doi:10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2021.06.001

目的

探究miR-148/152家族在多能干细胞衍生内皮细胞（ECs）中对糖酵解相关基因的调控作用。

方法

本研究以人胚胎干细胞（hESCs）株H1（WT）和采用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建的miR-148/152家族全敲除多能干细胞系（TKO）为基础；利用免疫荧光技术检测干细胞标志物NANOG的表达，评估WT和TKO干细胞的多能性；通过添加化学小分子和细胞因子如Wnt信号通路激活剂、碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子和骨形态发生蛋白4等，定向诱导hESCs向ECs分化；采用RT-qPCR检测miR-148/152家族在ECs中的敲除效率，并探究糖酵解关键酶和代谢转换关键基因在WT和TKO干细胞分化ECs中的表达差异。两组间比较采用独立样本t检验。

结果

与WT比较，TKO多能干细胞中miR-148a（1.00±0.03比0.00±0.00）、miR-148b（1.00±0.07比0.13±0.06）、miR-152（1.01±0.15比0.05±0.03）丰度降低，差异具有统计学意义（P均< 0.001）。WT和TKO hESCs均表达核定位的多能性标志分子NANOG，且均可定向分化为CD31阳性的ECs。与WT比较，TKO ECs中miR-148a（1.00±0.05比0.00±0.00）、miR- 148b（1.00±0.08比0.12±0.05）、miR-152（1.00±0.08比0.13±0.07）检测丰度降低，差异具有统计学意义（P均< 0.001）。与WT比较，TKO ECs中糖酵解关键酶如磷酸甘油酸激酶（1.00±0.09比0.20±0.02）、己糖激酶（1.02±0.20比0.55±0.12）、磷酸果糖激酶（1.00±0.05比0.67±0.14）、乳酸脱氢酶（1.00±0.04比0.53±0.05）、丙酮酸激酶（1.00±0.03比0.83±0.09）、3-磷酸甘油醛脱氢酶（1.00±0.03比0.59±0.09）的mRNA表达水平下调，而糖代谢向氧化磷酸化代谢转换过程中的重要基因丙酮酸脱氢酶激酶1（1.00±0.08比2.90±0.23）在敲除系中表达量升高，差异有统计学意义（P均< 0.05）。与WT比较，TKO ECs中糖酵解抑制因子磷脂酶和张力蛋白同源物的表达量升高（1.01±0.11比3.83±0.81，P < 0.001）。

结论

miR-148/152家族是调控ECs糖代谢的重要因子，可能在维持ECs糖酵解平衡，抑制其向氧化磷酸化代谢转换中发挥重要作用。

关键词: 人胚胎干细胞, microRNAs, 内皮细胞, 糖酵解

Objective

To explore the role of miR-148/152 family in the regulation of glycolysis-related genes in pluripotent stem cell-derived endothelial cells (ECs) .

Methods

In this study, we used the wild-type human embryonic stem cells (hESCs) strain H1 (WT) and the miR-148/152 family knockout hESCs line (TKO) , which was generated from H1 hESCs using CRISPR/Cas9 gene editing technology. The expression of pluripotent marker NANOG was detected by immunofluorescence technology. ECs were differentiated from both WT and TKO hESCs by subsequent treatment with chemical small molecules and cytokines such as Wnt signaling pathway activator, basic fibroblast growth factor, vascular endothelial growth factor and bone morphogenetic protein 4. RT-qPCR was performed to detect the knockout efficiency of miR-148/152 in the TKO ECs, and explore the effects of miR-148/152 family on the glycolytic metabolic enzymes and the metabolic transformation-related genes. Data between the two groups were compared by t test.

Results

Compared with the WT, the TKO hESCs showed significantly decreased detection abundance of miR-148a (1.00±0.03 vs 0.00±0.00) , miR- 148b (1.00±0.07 vs 0.13±0.06) , and miR-152 (1.01±0.15 vs 0.05±0.03) , (all P < 0.001) . A comparable expression of the pluripotency marker NANOG was detected in the nuclei of WT and TKO hESCs. Both WT and TKO hESCs can differentiate into CD31-positive ECs. Compared with the WT, the ECs derived from TKO hESCs showed significantly decreased detection abundance of miR-148a (1.00±0.05 vs 0.00±0.00) , miR-148b (1.00±0.08 vs 0.12±0.05) , and miR- 152 (1.00±0.08 vs 0.13±0.07) , (all P < 0.001) . The mRNA expression levels of key glycolytic enzymes, including phosphoglycerate kinase 1 (1.00±0.09 vs 0.20±0.02) , hexokinase 2 (1.02±0.20 vs 0.55±0.12) , 6-phosphofructo-2-kinase (1.00±0.05 vs 0.67±0.14) , lactate dehydrogenase A (1.00±0.04 vs 0.53±0.05) , pyruvate kinase M (1.00±0.03 vs 0.83±0.09) , glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (1.00±0.03 vs 0.59±0.09) , were significantly reduced in TKO hESC-derived ECs, when compared to that in the WT hESC-derived ECs (P < 0.05) . Moreover, the mRNA expression of pyruvate dehydrogenase kinase 1 (1.00±0.08 vs 2.90±0.23, P < 0.001) , a key gene in the process of metabolic transformation from glucose metabolism to oxidative phosphorylation metabolism, was significantly upregulated in TKO hESC-derived ECs. Consistently, expression level of the glycolysis suppressor phosphate and tension homology in the TKO ECs increased by about 4 folds when compared to that in the WT ECs (1.01±0.11 vs 3.83±0.81, P < 0.001) .

Conclusion

The miR-148/152 family is an important factor in regulating the glucose metabolism of ECs, and may contribute to maintaining the balance of glycolysis and inhibiting the glycolysis-to-oxidative phosphorylation transition.

Key words: Human embryonic stem cells, miRNAs, Endothelial cells, Glycolysis

表1 实时荧光定量PCR引物序列

基因	上游引物序列（5'-3'）	下游引物序列（5'-3'）	预期扩增产物长度（bp）
miR-148a	CGGCTGGGTCAGTGCACTA	CGCAGGGTCCGAGGTATTC	63
miR-148b	CGGCTGGGTCAGTGCATCA	CGCAGGGTCCGAGGTATTC	63
miR-152	CGGCTGGGTCAGTGCATGA	CGCAGGGTCCGAGGTATTC	62
U6	CTCGCTTCGGCAGCACA	AACGCTTCACGAATTTGCGT	94
18S	GTAACCCGTTGAACCCCATT	CCATCCAATCGGTAGTAGCG	151
PGK1	CCACTGTGGCTTCTGGCATA	ATGAGAGCTTTGGTTCCCCG	166
HK2	TGCCACCAGACTAAACTAGACG	CCCGTGCCCACAATGAGAC	227
LDHA	ATGGCAACTCTAAAGGATCAGC	CCAACCCCAACAACTGTAATCT	86
PDK1	GAGAGCCACTATGGAACACCA	GGAGGTCTCAACACGAGGT	187
PKM	ATGTCGAAGCCCCATAGTGAA	TGGGTGGTGAATCAATGTCCA	118
GAPDH	GAAGGTGAAGGTCGGAGT	GATGGCAACAATATCCACTT	94
GPI	AGGCTGCTGCCACATAAGGT	AGCGTCGTGAGAGGTCAC	240
PPARA	TTCGCAATCCATCGGCGAG	CCACAGGATAAGTCACCGAGG	146
PDK4	AGAGGTGGAGCATTTCTCGC	ATGTTGGCGAGTCTCACAGG	138
PFKFB3	GATGCCCTTCAGGAAAGCCT	GAACACTTTTGTGGGGACGC	148
PTEN	AGACCATAACCCACCACAGC	GGGAATAGTTACTCCCTTTTTGTCT	235

表1 实时荧光定量PCR引物序列

基因	上游引物序列（5'-3'）	下游引物序列（5'-3'）	预期扩增产物长度（bp）
miR-148a	CGGCTGGGTCAGTGCACTA	CGCAGGGTCCGAGGTATTC	63
miR-148b	CGGCTGGGTCAGTGCATCA	CGCAGGGTCCGAGGTATTC	63
miR-152	CGGCTGGGTCAGTGCATGA	CGCAGGGTCCGAGGTATTC	62
U6	CTCGCTTCGGCAGCACA	AACGCTTCACGAATTTGCGT	94
18S	GTAACCCGTTGAACCCCATT	CCATCCAATCGGTAGTAGCG	151
PGK1	CCACTGTGGCTTCTGGCATA	ATGAGAGCTTTGGTTCCCCG	166
HK2	TGCCACCAGACTAAACTAGACG	CCCGTGCCCACAATGAGAC	227
LDHA	ATGGCAACTCTAAAGGATCAGC	CCAACCCCAACAACTGTAATCT	86
PDK1	GAGAGCCACTATGGAACACCA	GGAGGTCTCAACACGAGGT	187
PKM	ATGTCGAAGCCCCATAGTGAA	TGGGTGGTGAATCAATGTCCA	118
GAPDH	GAAGGTGAAGGTCGGAGT	GATGGCAACAATATCCACTT	94
GPI	AGGCTGCTGCCACATAAGGT	AGCGTCGTGAGAGGTCAC	240
PPARA	TTCGCAATCCATCGGCGAG	CCACAGGATAAGTCACCGAGG	146
PDK4	AGAGGTGGAGCATTTCTCGC	ATGTTGGCGAGTCTCACAGG	138
PFKFB3	GATGCCCTTCAGGAAAGCCT	GAACACTTTTGTGGGGACGC	148
PTEN	AGACCATAACCCACCACAGC	GGGAATAGTTACTCCCTTTTTGTCT	235

表2 miRNA特异性反转录引物序列

基因	引物序列
miR-148a	GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAAAG
miR-148b	GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAAAG
miR-152	GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCCAAGT

表2 miRNA特异性反转录引物序列

基因	引物序列
miR-148a	GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAAAG
miR-148b	GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAAAG
miR-152	GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCCAAGT

图1 miR-148/152家族成员序列比对注：黄色标注为成员种子序列，红色字体为相同序列；miR-148/152家族成员序列高度相似，且具有相同种子序列

图2 WT和TKO人胚胎干细胞中miR-148/152家族成员的表达分析注：WT为野生型，TKO为miR-148/152家族基因敲除；TKO人胚胎干细胞中miR-148/152家族成员的检测丰度降低；实验设3个复孔，重复3次，^aP < 0.001

图3 激光共聚焦显微镜下观察干性标志物NANOG在WT和TKO干细胞中的表达分布（免疫荧光染色，×100）注：WT为对照；TKO为miR-148/152家族敲除；NANOG（绿色）为干性标志物，DAPI染细胞核；WT与TKO的NANOG均定位于细胞核中，表达无明显差异

表3 WT和TKO人胚胎干细胞中miR-148/152成员表达分析（±s）

分组	实验次数	miR-148a	miR-148b	miR-152
WT	3	1.00±0.03	1.00±0.07	1.01±0.15
TKO	3	0.00±0.00	0.13±0.06	0.05±0.03
t值		100.176	28.287	18.772
P值		< 0.001	< 0.001	< 0.001

表3 WT和TKO人胚胎干细胞中miR-148/152成员表达分析（±s）

分组	实验次数	miR-148a	miR-148b	miR-152
WT	3	1.00±0.03	1.00±0.07	1.01±0.15
TKO	3	0.00±0.00	0.13±0.06	0.05±0.03
t值		100.176	28.287	18.772
P值		< 0.001	< 0.001	< 0.001

图4 人胚胎干细胞来源内皮细胞分化流程注：CHIR为Wnt信号通路激活剂CHIR99021（第0、1天）；bFGF为碱性成纤维细胞生长因子（第2天）；BMP4为骨形态发生蛋白4（第3、4、5天）；VEGF为血管内皮生长因子（第3、4、5天）。MACS为磁珠分选

图5 激光共聚焦显微镜下观察内皮标志物CD31在WT和TKO内皮细胞中的表达分布（免疫荧光染色，×200）注：a图为野生型，b图为miR-148/152家族敲除；CD31（绿色）为内皮细胞标志物，DAPI（蓝色）染细胞核；WT与TKO内皮细胞中CD31均定位于细胞膜上，表达无明显差异

图6 WT和TKO内皮细胞中miR-148/152家族成员的表达分析注：WT为野生型，TKO为miR-148/152家族敲除；TKO内皮细胞中miR-148/152家族成员的检测丰度显著降低；实验设3个复孔，重复3次，^aP < 0.001

表4 WT和TKO内皮细胞中miR-148/152成员表达分析（±s）

分组	实验次数	miR-148a	miR-148b	miR-152
WT	3	1.00±0.05	1.00±0.08	1.00±0.08
TKO	3	0.00±0.00	0.12±0.05	0.13±0.07
t值		56.829	28.479	24.888
P值		< 0.001	< 0.001	< 0.001

表4 WT和TKO内皮细胞中miR-148/152成员表达分析（±s）

分组	实验次数	miR-148a	miR-148b	miR-152
WT	3	1.00±0.05	1.00±0.08	1.00±0.08
TKO	3	0.00±0.00	0.12±0.05	0.13±0.07
t值		56.829	28.479	24.888
P值		< 0.001	< 0.001	< 0.001

图7 糖酵解相关基因在WT和TKO内皮细胞中的表达分析注：WT为野生型，TKO为miR-148/152家族敲除；TKO内皮细胞中糖酵解相关基因表达量显著降低；实验设3个复孔，重复3次，^aP < 0.001，ns为无统计学意义

表5 WT和TKO组内皮细胞中糖酵解相关基因表达水平比较（±s）

分组	实验次数	PGK1	HK2	PFKFB3	LDHA	PKM	GAPDH	GPI
WT	3	1.00±0.09	1.02±0.20	1.00±0.05	1.00±0.04	1.00±0.03	1.00±0.03	1.00±0.03
TKO	3	0.20±0.02	0.55±0.12	0.67±0.14	0.53±0.05	0.83±0.09	0.59±0.09	1.08±0.15
t值		26.215	5.910	6.660	21.348	5.106	13.304	1.656
P值		< 0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001	0.117

表5 WT和TKO组内皮细胞中糖酵解相关基因表达水平比较（±s）

分组	实验次数	PGK1	HK2	PFKFB3	LDHA	PKM	GAPDH	GPI
WT	3	1.00±0.09	1.02±0.20	1.00±0.05	1.00±0.04	1.00±0.03	1.00±0.03	1.00±0.03
TKO	3	0.20±0.02	0.55±0.12	0.67±0.14	0.53±0.05	0.83±0.09	0.59±0.09	1.08±0.15
t值		26.215	5.910	6.660	21.348	5.106	13.304	1.656
P值		< 0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001	0.117

图8 氧化磷酸化相关基因在WT和TKO内皮细胞中的表达分析注：WT为野生型，TKO为miR-148/152家族敲除；TKO内皮细胞中PDK1表达量上升；实验设3个复孔，重复3次，^aP < 0.001，ns为差异无统计学意义

表6 WT和TKO内皮细胞中氧化磷酸化相关基因表达水平比较（±s）

分组	实验次数	PDK1	PDK4	PPARα
WT	3	1.00±0.08	1.00±0.02	1.00±0.09
TKO	3	2.90±0.23	1.18±0.31	1.09±0.12
t值		22.917	1.698	0.033
P值		<0.001	0.109	0.974

表6 WT和TKO内皮细胞中氧化磷酸化相关基因表达水平比较（±s）

分组	实验次数	PDK1	PDK4	PPARα
WT	3	1.00±0.08	1.00±0.02	1.00±0.09
TKO	3	2.90±0.23	1.18±0.31	1.09±0.12
t值		22.917	1.698	0.033
P值		<0.001	0.109	0.974

图9 miR-148/152家族靶基因磷脂酶和张力蛋白同源物在WT和KO内皮细胞中的表达分析注：黄色标注为miR-148/152家族种子序列与靶基因磷脂酶和张力蛋白同源物的结合位点；WT为野生型，TKO为miR-148/152家族敲除，PTEN为磷脂酶和张力蛋白同源物；TKO内皮细胞中磷脂酶和张力蛋白同源物表达量显著升高；实验设3个复孔，重复3次，^aP < 0.001

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Role of miR-148/152 family in regulating the expression of glycolysis-related genes in endothelial cells

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