围绝经期干眼患者结膜上皮细胞中miR-146a、TRAF6的表达研究

doi:10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2021.05.004

目的

检测围绝经期干眼患者结膜上皮细胞中微小RNA （miR）-146a、肿瘤坏死因子受体相关因子6 （TRAF6）表达水平并探讨其作用。

方法

选取2017年10月至2019年12月在河北省石家庄爱尔眼科医院就诊的围绝经期干眼患者86例为观察组，同期处于围绝经期的健康体检者90例为对照组。采集两组结膜上皮细胞，荧光定量PCR （RT-qPCR）检测miR-146a及TRAF6、白细胞介素（IL）-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α （TNF-α）mRNA表达水平；Western blot法检测TRAF6蛋白表达水平。采用Pearson相关分析miR-146a与TRAF6 mRNA水平及二者与IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA水平的相关性；采用多因素Logistic回归分析影响围绝经期发生干眼的因素。

结果

与对照组比较，观察组围绝经期干眼患者结膜上皮细胞中miR-146a（1.09±0.06比1.53±0.27）、IL-1β （1.02±0.11比1.52±0.17）、IL-6 （1.04±0.03比1.31±0.15）和TNF-α mRNA表达水平（1.01±0.05比1.28±0.15）均升高，TRAF6 mRNA （1.03±0.04比0.62±0.15）和TRAF6蛋白表达水平（0.65±0.07比0.38±0.05）均降低（P均< 0.05）；围绝经期干眼患者结膜上皮细胞中miR-146a表达水平与TRAF6、IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表达水平呈负相关（r = -0.455、-0.416、-0.441、-0.511，P < 0.05），TRAF6 mRNA表达水平与IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表达水平呈正相关（r = 0.442、0.483、0.465，P < 0.05）；结膜上皮细胞中miR- 146a表达水平为影响围绝经期发生干眼的保护因素，TRAF6、IL-6 mRNA表达水平为影响围绝经期发生干眼的独立危险因素（P均< 0.05）。

结论

围绝经期干眼患者结膜上皮细胞中miR-146a表达上调，TRAF6表达下调，二者可能通过调控炎症反应参与疾病调控过程。

关键词: 围绝经期, 干眼, 结膜上皮细胞, miR-146a, 肿瘤坏死因子受体相关因子6

Objective

To detect the expression of microRNA-146a (miR-146a) and tumor necrosis factor receptor associated factor-6 (TRAF6) in conjunctival epithelial cells of perimenopausal patients with dry eyes and explore their effects.

Methods

From October 2017 to December 2019, 86 cases of perimenopausal dry eye patients (observation group) and 90 cases of healthy physical examinees (control group) were selected. The conjunctival epithelial cells of the patients in two groups were collected, the expression of miR-146a, TRAF6, interleukin (IL) - 1β, IL-6 and tumor necrosis factor-α (TNF-α) mRNAs were detected by quantitative real-time PCR (RT- qPCR) ; the expression of TRAF6 protein was detected by western blot (WB) ; Pearson correlation was used to analyze the correlation between the levels of miR-146a and TRAF6 mRNA, and the correlations between them and the levels of IL-1β, IL-6, TNF-α mRNA; and multivariate Logistic regression analysis was used to analyze the factors influencing dry eye in perimenopause.

Results

Compared with the control group, the expression levels of miR-146a (1.09±0.06 vs 1.53±0.27) , IL-1β (1.02±0.11 vs 1.52±0.17) , IL-6 (1.04±0.03 vs 1.31±0.15) and TNF-α mRNAs (1.01±0.05 vs 1.28±0.15) in the conjunctival epithelial cells of the observation group were significantly higher (P < 0.05) , and the expression levels of TRAF6 mRNA (1.03±0.04 vs 0.62±0.15) and TRAF6 protein (0.65±0.07 vs 0.38±0.05) were significantly lower (P < 0.05) ; there was a significantly negative correlation between the expression of miR-146a and TRAF6, IL- 1β, IL-6, TNF-α mRNAs (r = -0.455, -0.416, -0.441, -0.511, P < 0.05) , and there was a significantly positive correlation between the expression of TRAF6 mRNA and IL-1β, IL-6, TNF-α mRNAs (r = 0.442, 0.483, 0.465, P < 0.05) ; miR-146a in conjunctival epithelial cells was a protective factor of perimenopausal dry eye (P < 0.05) , and TRAF6 and IL-6 mRNA were independent risk factors for perimenopausal dry eye (P < 0.05) .

Conclusion

miR-146a is up-regulated and TRAF6 is down-regulated in conjunctival epithelial cells of perimenopausal dry eye patients, which may be involved in the process of disease regulation by regulating inflammatory reaction.

Key words: Perimenopausal, Dry eye, Conjunctival epithelial cells, miR-146a, Tumor necrosis factor receptor associated factor-6

表1 引物序列信息

基因	序列（5'→3'）	预期扩增产物长度（bp）
miR-146a	上游AGAACTGAATTCCATGGGTT	99
	下游GACAGAGATATCCCAGCTGAAGAA	99
TRAF6	上游CTGCAAAGCCTGCATCATAA	224
	下游GGGGACAATCCATAAGAGCA	224
IL-1β	上游AGGGACATGGAGAAGCGATTT	108
	下游TTCTGCTTGAGAGGTGCTGATG	108
IL-6	上游ACTCACCTCTTCAGAACGAATTG	149
	下游CCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTG	149
TNF-α	上游CCTCTCTCTAATCAGCCCTCTG	220
	下游GAGGACCTGGGAGTAGATGAG	220
U6（内参）	上游CTCGCTTCGGCAGCACA	96
	下游AACGCTTCACGAATTTGCGT	96
GAPDH （内参）	上游GCACCGTCAAGGCTGAGAAC	138
	下游TGGTGAAGACGCCAGTGGA	138

表1 引物序列信息

基因	序列（5'→3'）	预期扩增产物长度（bp）
miR-146a	上游AGAACTGAATTCCATGGGTT	99
	下游GACAGAGATATCCCAGCTGAAGAA	99
TRAF6	上游CTGCAAAGCCTGCATCATAA	224
	下游GGGGACAATCCATAAGAGCA	224
IL-1β	上游AGGGACATGGAGAAGCGATTT	108
	下游TTCTGCTTGAGAGGTGCTGATG	108
IL-6	上游ACTCACCTCTTCAGAACGAATTG	149
	下游CCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTG	149
TNF-α	上游CCTCTCTCTAATCAGCCCTCTG	220
	下游GAGGACCTGGGAGTAGATGAG	220
U6（内参）	上游CTCGCTTCGGCAGCACA	96
	下游AACGCTTCACGAATTTGCGT	96
GAPDH （内参）	上游GCACCGTCAAGGCTGAGAAC	138
	下游TGGTGAAGACGCCAGTGGA	138

图1 Western blot检测TRAF6蛋白表达水平

表2 两组结膜上皮细胞中miR-146a、TRAF6 mRNA及蛋白表达水平比较（ ± s）

分组	例数	miR-146a	TRAF6 mRNA	TRAF6/GAPDH
对照	90	1.09±0.06	1.03±0.04	0.65±0.07
观察	86	1.53±0.27	0.62±0.15	0.38±0.05
t值		15.077	25.019	29.327
P值		< 0.001	< 0.001	< 0.001

表2 两组结膜上皮细胞中miR-146a、TRAF6 mRNA及蛋白表达水平比较（ ± s）

分组	例数	miR-146a	TRAF6 mRNA	TRAF6/GAPDH
对照	90	1.09±0.06	1.03±0.04	0.65±0.07
观察	86	1.53±0.27	0.62±0.15	0.38±0.05
t值		15.077	25.019	29.327
P值		< 0.001	< 0.001	< 0.001

表3 两组结膜上皮细胞中IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA表达水平比较（ ± s）

分组	例数	IL-1β mRNA	IL-6 mRNA	TNF-α mRNA
对照	90	1.02±0.11	1.04±0.03	1.01±0.05
观察	86	1.52±0.17	1.31±0.15	1.28±0.15
t值		23.268	16.732	16.164
P值		< 0.001	< 0.001	< 0.001

表3 两组结膜上皮细胞中IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA表达水平比较（ ± s）

分组	例数	IL-1β mRNA	IL-6 mRNA	TNF-α mRNA
对照	90	1.02±0.11	1.04±0.03	1.01±0.05
观察	86	1.52±0.17	1.31±0.15	1.28±0.15
t值		23.268	16.732	16.164
P值		< 0.001	< 0.001	< 0.001

图2 围绝经期干眼患者结膜上皮细胞中miR-146a与TRAF6水平及二者与IL-1β、IL-6、TNF-α水平的相关性分析

表4 影响围绝经期发生干眼的多因素分析

影响因素	B	SE	Wald	P值	OR	95﹪CI
miR-146a	- 0.423	0.147	8.285	0.004	0.655	0.491 ~ 0.874
TRAF6	0.421	0.103	16.681	< 0.001	1.523	1.245 ~ 1.864
IL-1β	0.198	1.136	2.120	0.145	1.219	0.934 ~ 1.591
IL-6	0.606	0.282	4.617	0.032	1.833	1.055 ~ 3.186
TNF-α	0.497	0.314	2.507	0.113	1.644	0.888 ~ 3.042
常数项	- 1.877	0.374	25.196	< 0.001	0.153	-

表4 影响围绝经期发生干眼的多因素分析

影响因素	B	SE	Wald	P值	OR	95﹪CI
miR-146a	- 0.423	0.147	8.285	0.004	0.655	0.491 ~ 0.874
TRAF6	0.421	0.103	16.681	< 0.001	1.523	1.245 ~ 1.864
IL-1β	0.198	1.136	2.120	0.145	1.219	0.934 ~ 1.591
IL-6	0.606	0.282	4.617	0.032	1.833	1.055 ~ 3.186
TNF-α	0.497	0.314	2.507	0.113	1.644	0.888 ~ 3.042
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Expression of miR-146a and TRAF6 in conjunctival epithelial cells of perimenopausal patients with dry eyes

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