青光安颗粒剂对TGF-β1诱导的HTFs增殖影响的实验研究

doi:10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2019.02.003

目的

探讨青光安颗粒剂抑制转化生长因子β1 （TGF-β1）诱导的人类Tenon成纤维细胞（HTFs）增殖的可能机制。

方法

从接受青光眼滤过手术（GFS）的个体获得人结膜下Tenon胶囊样品。实验设计分为3组：对照组（HTFs未经处理，n = 10）；TGF-β1诱导组（100 ng/ ml TGF-β1诱导HTFs，构建GFS术后细胞模型，n = 10）；TGF-β1+青光安治疗组（TGF-β1诱导+青光安颗粒剂血清处理HTFs，n = 30）。TGF-β1+青光安治疗组按照青光安血清的剂量进一步分为3组：TGF-β1+青光安高剂量组（TGF-β1诱导+青光安颗粒剂血清5 ml处理HTFs）；TGF-β1+青光安中剂量组（TGF-β1诱导+青光安颗粒剂血清2.5 ml处理HTFs）；TGF-β1+青光安低剂量组（TGF-β1诱导+青光安颗粒剂血清处理1 ml HTFs）；每组设10个培养皿。通过CCK-8检测青光安对TGF-β1诱导HTFs增殖的影响；通过流式细胞术评估青光安对细胞周期的影响；通过Cyto-ID免疫细胞化学染色测定青光安颗粒剂对HTFs细胞自噬的影响；采用RT-PCR和Western Blot法测定自噬体形成的必需蛋白质Beclin-1，ATG-5和LC3-Ⅲ基因和蛋白的表达水平。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。

结果

青光安能够抑制TGF-β1诱导HTFs的增殖能力，TGF-β1+青光安高剂量组细胞增殖水平（13.52±1.24）较TGF-β1诱导组（23.42±1.25）降低，差异有统计学意义（F = 12.347，P < 0.01）；TGF-β1诱导G0/ G1期的比例（88.29±0.35）降低，而S期的比例（9.04±0.25）升高，而青光安治疗能够导致G0/ G1期的比例（91.18±1.04）增加，而S期的比例（5.41±0.59）降低，差异有统计学意义（F = 13.857，P < 0.01）；与TGF-β1诱导组相比，用TGF-β1+青光安治疗组导致荧光染色强度（1.84±0.14）降低，HTFs阳性细胞数目（112.46±12.11）减少，差异有统计学意义（F = 12.347，P = 18.472）；TGF-β1+青光安治疗组能抑制TGF-β1诱导对自噬基因Beclin-1、ATG-5和LC- 3Ⅲ mRNA和蛋白质表达增加（P < 0.05）。

结论

青光安颗粒剂抑制TGF-β1诱导的HTFs增殖，且可能机制为青光安诱导HTFs细胞周期停滞于G0/G1期，而且青光安可减少TGF-β1诱导的HTFs自噬。

关键词: 青光眼, 青光安颗粒剂, Tenon's囊成纤维细胞, 自噬, 滤过性手术

Objective

To explore the possible mechanism of Qingguang' an granule inhibiting the proliferation of HTFs induced by TGF-β1.

Methods

Samples of human subconjunctival Tenon capsules were obtained from individuals undergoing GFS surgery. The experimental design was divided into three groups: a control group (HTFs untreated, n = 10) ; TGF- β1 induction group (100 ng/ml TGF-β1 induced HTFs, constructed cell model after GFS, n = 10) ; TGF-β1 + Qingguang' an treatment group (TGF-β1 induced + Qingguang' an granule serum treated HTFs, n = 30). The treatment group was further divided into three groups according to the dose of Qingguang' an serum: the high dose group of TGF-β1 + Qingguang' an (TGF-β1 induction + Qingguang' an granule serum 5 ml for HTFs), the medium dose group of TGF-β1 + Qingguang' an granule serum 2.5 ml for HTFs, and the low dose group of TGF-β1 + Qingguang' an granule serum 1 ml for HTFs; There were 10 Petri dishes in each group. The effect of glaucoma on the proliferation of TGF-β1-induced HTFs was detected by CCK-8; the effect of glaucoma on cell cycle was evaluated by flow cytometry; the Cyans granules were determined by Cyto-ID immunocytochemical staining. The effect of autophagic cells; the expression levels of the essential proteins Beclin-1, ATG-5 and LC3-Ⅲ genes and proteins formed by autophagosomes were determined by RT-PCR and Western Blot.

Results

Qingguang' an inhibited the proliferation of HTFs cells induced by TGF-beta1. The proliferation level of HTFs cells in the high dose group of TGF-β1+Qingguang' an (13.52±1.24) was lower than that in the high dose group of TGF-β1 (23.42±1.25), with a statistically significant difference (F = 12.347, P < 0.001) ; the proportion of G0/G1 phase induced by TGF-β1 (88.29±0.35) was lower, while the proportion of S phase (9.04±0.25) was higher. The proportion of G0/G1 phase was increased (91.18±1.04), while that of S phase was decreased (5.41+0.59), with a significant difference (F = 13.857, P = 0.007) ; compared with TGF-β1 induced group, the intensity of fluorescence staining decreased (1.84+0.14) and the number of HTFs-positive cells was decreased (112.46+12.11), with a significant difference (F = 12.347, P = 18.472). TGF-β1 + Qingguang' an treatment group inhibited the increase of expression of autophagy gene Beclin-1, ATG-5 and LC-3Ⅲ mRNA and protein induced by TGF-β1 (P < 0.05) .

Conclusion

Qingguang' an granule inhibits the proliferation of HTFs induced by TGF-β1, and the possible mechanism is that Qingguang' an induces HTFs cell cycle to stagnate at G0/G1 phase, and Qingguang' an can reduce the autophagy of HTFs induced by TGF-β1.

Key words: Glaucoma, Qingguangan granules, Tenon's capsule fibroblasts, Autophagy, Filtration surgery

表1 RT-PCR引物序列

基因	上游引物	下游引物
Beclin-1	AACTGTTGCCTATCGGCAAT	TTGCCATGAATTGTAAAACGCA
ATG-5	CCTTAGCATCGGGTAACTACGC	AGCTGCAATTGGACCAGATTTC
LC-3Ⅲ	AATGCCGTTAACGCATTGCAGTAC	GTGTACGTAGCGTGGAACTA
GADPH	AACAGTCCGCCTAGA AGCAC	CGTTGACATCCG TAA AGACC

表1 RT-PCR引物序列

基因	上游引物	下游引物
Beclin-1	AACTGTTGCCTATCGGCAAT	TTGCCATGAATTGTAAAACGCA
ATG-5	CCTTAGCATCGGGTAACTACGC	AGCTGCAATTGGACCAGATTTC
LC-3Ⅲ	AATGCCGTTAACGCATTGCAGTAC	GTGTACGTAGCGTGGAACTA
GADPH	AACAGTCCGCCTAGA AGCAC	CGTTGACATCCG TAA AGACC

表2 青光安颗粒剂抑制HTFs的活力（

± s）

分组	细胞培养皿数量	增殖能力
对照组	10	12.85±1.13
TGF-β1诱导组	10	23.42±1.25^a
TGF-β1+青光安低剂量组	10	19.47±1.14^b
TGF-β1+青光安中剂量组	10	16.38±1.07^b
TGF-β1+青光安高剂量组	10	13.52±1.24^b
F值		12.347
P值		< 0.01

表2 青光安颗粒剂抑制HTFs的活力（

± s）

分组	细胞培养皿数量	增殖能力
对照组	10	12.85±1.13
TGF-β1诱导组	10	23.42±1.25^a
TGF-β1+青光安低剂量组	10	19.47±1.14^b
TGF-β1+青光安中剂量组	10	16.38±1.07^b
TGF-β1+青光安高剂量组	10	13.52±1.24^b
F值		12.347
P值		< 0.01

表3 TGF-β1和青光安治疗对HTFs细胞周期的影响（%，

± s）

分组	细胞培养皿数量	G0/G1期	S期	G2/M期
对照组	10	94.92 ± 1.63	1.61 ± 0.72	3.47 ± 1.11
TGF-β1诱导组	10	88.29 ± 0.35^a	9.04 ± 0.25^a	2.67 ± 0.15
TGF-β1+青光安治疗组	30	91.18 ± 1.04^b	5.41 ± 0.59^b	3.41 ± 0.53
F值		15.374	13.857	18.263
P值		0.012	0.007	0.432

表3 TGF-β1和青光安治疗对HTFs细胞周期的影响（%，

± s）

分组	细胞培养皿数量	G0/G1期	S期	G2/M期
对照组	10	94.92 ± 1.63	1.61 ± 0.72	3.47 ± 1.11
TGF-β1诱导组	10	88.29 ± 0.35^a	9.04 ± 0.25^a	2.67 ± 0.15
TGF-β1+青光安治疗组	30	91.18 ± 1.04^b	5.41 ± 0.59^b	3.41 ± 0.53
F值		15.374	13.857	18.263
P值		0.012	0.007	0.432

表4 青光安颗粒剂对HTFs细胞自噬的影响（

± s）

分组	细胞培养皿数量	荧光强度	阳性细胞数目
对照组	10	1.37±0.15	83.46±10.78
TGF-β1诱导组	10	4.64±0.25^a	180.54±20.37^a
TGF-β1+青光安治疗组	30	1.84±0.14^b	112.46±12.11^b
F值		12.375	18.472
P值		0.001	0.004

表4 青光安颗粒剂对HTFs细胞自噬的影响（

± s）

分组	细胞培养皿数量	荧光强度	阳性细胞数目
对照组	10	1.37±0.15	83.46±10.78
TGF-β1诱导组	10	4.64±0.25^a	180.54±20.37^a
TGF-β1+青光安治疗组	30	1.84±0.14^b	112.46±12.11^b
F值		12.375	18.472
P值		0.001	0.004

图1 荧光显微镜下观察Cyto-ID免疫细胞化学SP染色结果（×400）注：a图为对照组，b图为TGF-β1诱导组，c图为TGF-β1+青光安治疗组。对照HTFs在细胞质中表现出弱的绿色点状染色。在用TGF-β1处理后，在细胞中显示出增强的HTFs细胞自噬

表5 自噬相关基因mRNA的表达水平（

± s）

分组	细胞培养皿数量	Beclin-1	ATG-5	LC-3Ⅲ
对照组	10	5.43±0.97	8.24±1.03	6.43±0.85
TGF-β1诱导组	10	2.25±0.54^a	4.32±0.69^a	3.54±0.96^a
TGF-β1+青光安治疗组	30	4.97±0.68^b	7.36±0.85^b	5.83±0.25^b
F值		9.654	16.866	17.675
P值		< 0.01	< 0.01	< 0.01

表5 自噬相关基因mRNA的表达水平（

± s）

分组	细胞培养皿数量	Beclin-1	ATG-5	LC-3Ⅲ
对照组	10	5.43±0.97	8.24±1.03	6.43±0.85
TGF-β1诱导组	10	2.25±0.54^a	4.32±0.69^a	3.54±0.96^a
TGF-β1+青光安治疗组	30	4.97±0.68^b	7.36±0.85^b	5.83±0.25^b
F值		9.654	16.866	17.675
P值		< 0.01	< 0.01	< 0.01

图2 自噬相关基因mRNA的表达水平

表6 HTFs中自噬相关基因表达量（

± s）

分组	细胞培养皿数量	Beclin-1	ATG-5	LC-3Ⅲ
对照组	10	2.36±0.25	0.87±0.06	1.84±0.24
TGF-β1诱导组	10	3.47±0.38^a	1.32±0.11^a	2.78±0.21^a
TGF-β1+青光安治疗组	30	1.78±0.04^b	0.92±0.15^b	1.92±0.34^b
F值		17.368	14.582	13.264
P值		< 0.01	< 0.01	< 0.01

表6 HTFs中自噬相关基因表达量（

± s）

分组	细胞培养皿数量	Beclin-1	ATG-5	LC-3Ⅲ
对照组	10	2.36±0.25	0.87±0.06	1.84±0.24
TGF-β1诱导组	10	3.47±0.38^a	1.32±0.11^a	2.78±0.21^a
TGF-β1+青光安治疗组	30	1.78±0.04^b	0.92±0.15^b	1.92±0.34^b
F值		17.368	14.582	13.264
P值		< 0.01	< 0.01	< 0.01

图3 免疫印迹分析Beclin-1、ATG-5和LC-3Ⅲ蛋白的表达量

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