补骨脂素对前列腺癌LNCap-AD细胞增殖的影响及其分子机制研究

doi:10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2017.04.006

目的

观察补骨脂素对体外培养的前列腺癌LNCaP-AD细胞增殖的抑制作用，并探讨补骨脂素抑制前列腺癌的作用机制。

方法

体外培养前列腺癌LNCaP-AD细胞，加入不同浓度的补骨脂素，CCK-8法检测细胞增殖抑制率、实时荧光定量PCR检测细胞AR mRNA的表达、Western Blot检测细胞PCNA和AR蛋白表达。采用单因素方差分析进行组间均数比较。

结果

与对照组相比，30、50、100 μg/ml补骨脂素组LNCaP-AD细胞存活率均明显下降（P < 0.05），补骨脂素对LNCaP-AD细胞增殖的抑制作用呈浓度-时间依赖性。实时荧光定量PCR检测结果显示，与对照组（1.00±0.00）相比，30 μg/ml组AR mRNA表达上调（1.63±0.04，t =?17.72，P < 0.01），50 μg/ml组AR mRNA表达无明显变化（0.98±0.04，t = 0.66，P = 0.53）、而100 μg/ml组的AR mRNA表达则明显降低（0.46±0.07，t = 15.18，P < 0.01）。Western blot法检测结果显示，30 μg/ml、50 μg/ml、100 μg/ml的补骨脂素干预48 h后，LNCaP-AD细胞PCNA蛋白表达均显著降低（11.88±0.21 vs 10.61±0.17 vs 6.62±0.13 vs 2.71±0.43, F = 68.53, P < 0.01）。100 μg/ml的补骨脂素可明显降低LNCaP-AD细胞AR蛋白的表达水平（0.43±0.06 vs 0.87±0.04，t = 6.04，P < 0.01）。

结论

补骨脂素能在体外抑制前列腺癌LNCaP-AD细胞增殖，且呈剂量-时间依赖性，其机制可能与其下调LNCaP-AD细胞PCNA表达和影响AR表达有关。

关键词: 补骨脂素类, 前列腺肿瘤, 增殖细胞核抗原, 受体，雄激素

Objective

To explore the influence of psoralen on the proliferation of prostate cancer LNCaP-AD cells and its mechanism.

Methods

Psoralen with different concentration was added into LNCaP-AD cells cultured in vitro. The effect of psoralen on the proliferation inhibition of LNCaP-AD cells was detected by CCK-8. The expressions of AR mRNA and protein, as well as PCNA protein, were respectively determined by real time PCR and Western blot.

Results

CCK-8 test showed that psoralen significantly inhibited the proliferation of LNCaP-AD cells in a dose- and time-dependent manner (P < 0.05) . Real time PCR showed that the expression of AR mRNA in LNCaP-AD cells was up-regulated by 30 μg/ml psoralen (1.63±0.04, t = 17.72, P < 0.01) , down-regulated by 100 μg/ml psoralen (0.46±0.07, t = 15.18, P < 0.01) and had no difference by 50 μg/ml psoralen (0.98±0.04, t = 0.66, P = 0.53) when compared with the control group (1.00±0.00) . Western blot showed that the protein expression of PCNA was down-regulated by 30 μg/ml, 50 μg/ml and 100 μg/ml psoralen in a dose-dependent manner compared (11.88?± 0.21 vs 10.61±0.17 vs 6.62?±?0.13 vs 2.71±0.43, F = 68.53, P < 0.01) . The protein expression level of AR was significantly down-regulated by 100 μg/ml psoralen compared with the control group (0.43?±0.06 vs 0.87±0.04, t = 6.04, P < 0.01) .

Conclusion

Psoralen can inhibit the proliferation of LNCaP-AD cells in a dose- and time-dependent manner in vitro. The possible mechanism lays in the down-regulation of PCNA and the influence of AR expression in LNCaP-AD cells.

Key words: Psoralens, Prostatic neoplasms, Proliferating cell nuclear antigen, Receptors, androgen

表1 AR及β-Actin基因引物序列

基因	引物
AR	F:5'-AGTCAATGGGCAAAACATGG-3'
?	R: 5'- TTGTGTCAAAAGCGAAATGG-3'
β-actin	F: 5'- GTTGTCGACGACGAGCG-3'
?	R: 5'- GCACAGAGCCTCGCCTT-3'

表1 AR及β-Actin基因引物序列

基因	引物
AR	F:5'-AGTCAATGGGCAAAACATGG-3'
?	R: 5'- TTGTGTCAAAAGCGAAATGG-3'
β-actin	F: 5'- GTTGTCGACGACGAGCG-3'
?	R: 5'- GCACAGAGCCTCGCCTT-3'

表2 不同培养时间下补骨脂素体外对LNCaP-AD细胞的生存率的影响（±s）

分组	例数	24 h	48 h	72 h	96 h	F值	P值
10 μg/ml	15	0.96±0.07	0.84±0.05	0.82±0.08	0.65±0.07	19.03	< 0.01
30 μg/ml	15	0.94±0.07	0.80±0.04^a	0.77±0.04^a	0.63±0.06^a	26.03	< 0.01
50 μg/ml	15	0.89±0.09^a	0.76±0.13^a	0.72±0.09^a	0.61±0.08^a	6.92	< 0.01
100 μg/ml	15	0.78±0.05^a	0.60±0.02^a	0.56±0.03^a	0.42±0.05^a	59.45	< 0.01
F值	?	8.77	24.54	38.95	60.95	?	?
P值	?	< 0.01	< 0.01	< 0.01	< 0.01	?	?

表2 不同培养时间下补骨脂素体外对LNCaP-AD细胞的生存率的影响（±s）

分组	例数	24 h	48 h	72 h	96 h	F值	P值
10 μg/ml	15	0.96±0.07	0.84±0.05	0.82±0.08	0.65±0.07	19.03	< 0.01
30 μg/ml	15	0.94±0.07	0.80±0.04^a	0.77±0.04^a	0.63±0.06^a	26.03	< 0.01
50 μg/ml	15	0.89±0.09^a	0.76±0.13^a	0.72±0.09^a	0.61±0.08^a	6.92	< 0.01
100 μg/ml	15	0.78±0.05^a	0.60±0.02^a	0.56±0.03^a	0.42±0.05^a	59.45	< 0.01
F值	?	8.77	24.54	38.95	60.95	?	?
P值	?	< 0.01	< 0.01	< 0.01	< 0.01	?	?

图1 补骨脂素对LNCaP-AD细胞AR mRNA表达的影响（n= 6）

表3 补骨脂素对LNCaP-AD细胞PCNA蛋白表达的影响（±s）

分组	例数	PCNA	AR
对照组	3	0.89±0.05	0.87±0.04
30 μg/ml	3	0.77±0.03^a	1.58±0.14^a
50 μg/ml	3	0.48±0.08^a	0.81±0.08
100 μg/ml	3	0.29±0.07^a	0.43±0.06^a
F值	?	68.53	89.55
P值	?	< 0.01	< 0.01

表3 补骨脂素对LNCaP-AD细胞PCNA蛋白表达的影响（±s）

分组	例数	PCNA	AR
对照组	3	0.89±0.05	0.87±0.04
30 μg/ml	3	0.77±0.03^a	1.58±0.14^a
50 μg/ml	3	0.48±0.08^a	0.81±0.08
100 μg/ml	3	0.29±0.07^a	0.43±0.06^a
F值	?	68.53	89.55
P值	?	< 0.01	< 0.01

图2 Western blot法检测补骨脂素对LNCaP-AD细胞PCNA和AR蛋白表达的影响

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Investigation of effect of psoralen on proliferation of prostate cancer LNCap-AD cells and its underlying molecular mechanism

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